随着肾移植技术的日趋成熟，现已成为治疗终末肾病最有效的方法。但排异导致的移植肾失功常常成为肾移植失败的最大障碍。移植前后hla抗体的存在与移植肾排异和失功有关。然而，hla抗体阴性的移植肾患者同样发生移植肾排异，提示可能有非hla抗体在超急性、急性和移植肾失功发挥了重要作用。对于hla抗体阴性的患者，如何确定排异及排异的类型对于排异的控制及预测其预后都是至关重要的问题，而mica(mhcclass1chain?relateda，主要组织相容性ⅰ类相关链a位点)抗体在这方面有着明显的应用价值，移植前体内预存mica抗体不仅是急性排斥的因素之一，而且与移植后慢性排斥和移植肾功能减退相关，清除体内预存的mica抗体有利于移植成功[1]。近年来，mica抗体逐渐成为人们研究的热点。本文旨在讨论mica抗体的特性、检测方法及其临床意义，并就其研究进展进行综述。
1mica特性
1.1mica的基因和分子结构
1994年首先报道了位于6号染色体的mhc?i链相关基因(mic)[2]。目前，人类mhc基因图谱已经研究确定有7个mic基因(mica?micg)，其中只有mica和micb编码、表达、转录，micc,micd,mice,micf和micg是假基因。mica和micb分别位于hla?b着丝粒段46.4kb和141.2kb。mica编码383～389个氨基酸的膜结合蛋白，micb编码383个氨基酸，而且两者有83%的蛋白类似。这些基因编码分子量为62kd的细胞表面糖蛋白。mica(11.7kb)和micb(12.9kb)基因的组成分析表明这些基因的长度要比mhc?i类分子长，如hla?b。1999年，spie's和rolandstrong研究小组通过mica产物晶体结构的详细分析，推测出mic分子构象。x?射线衍射和蛋白晶体分子模型分析显示了mica和经典hla?ⅰ分子的相似性和差异性。最显著的差异在于mica分子α2功能域有一个明显无序的多肽结构，导致在晶体结构中有一个不可见的易弯曲的环(loop)[3]，loop结构可能在mica与其受体结合时发挥重要作用。mica、micb位于hla?ⅰ类基因区靠近ⅰ类基因一侧，mic的区域结构类似于经典hla-ⅰ类分子，3个胞外区(α1、α2、α3)、一个跨膜区、一个胞质尾区,但与hla?ⅰ类基因同源性较差，仅28%～30%，而mica、micb之间同源性有84%。mics的分子折叠、结构稳定性及其在细胞表面的表达均不需要结合抗原肽，也不需β2微球蛋白的辅助。因为它们是膜结合抗原，并且只表达在缺少β2微球蛋白的细胞表面[4]。其次从晶体结构上看，mica虽然也有如经典ⅰ类分子样的α1、α2、α3功能区，但是其空间结构发生了较大变化。虽然α1、α2也可形成抗原结合槽样结构，但其仅能容纳小于3～4个氨基酸残基，这提示mics不能结合抗原肽。α3与α2、α1间的连接肽易于伸展，从而使各功能区之间更富变动性，这也是mics较为独特的性质。
1.2mica基因的多态性
mica和micb基因的多态性虽不如经典的hla?i类基因丰富，但亦很高，现已发现有61个mica等位基因和30个micb等位基因[5，6]。如果将来对更多的种族检测，等位基因的数量可能进一步增加,但是有3个最普通的等位基因，分别为mica*00801(>25%)、mica*00201(>10%)、mica*004(>10%)。fodil等在mica基因外显子2?4(编码胞外结构域α1?α3)的核苷酸序列中共发现有27个核苷酸变异,其中22个是非同义改变(4/6在α1，10/10在α2，8/11在α3)，在α1?α3中共有16个mica等位基因的变异体[7]。mica分子多态残基分布在整个分子的胞外部分,但在α2结构域中略有优势。此外,日本学者在mica基因外显子5(编码跨膜区)发现了三核苷酸重复顺序(gct)n微卫星多态性。到目前为止，检测到该微卫星顺序8个独特的等位基因，分别被称为mica的?a4、?a5、?a6、?a9、?a7、?a10、?a9.1和?a5.1等位基因[6,8]。前6个分别代表(gct)的重复拷贝数为4、5、6、9、7、10，?a5.1则是在?a5的基础插入1个g，即(gct)4ggct。这个(ggct)序列导致移码突变，在tm区产生一个早期出现的终止密码子，编码一个可溶性的分泌型的mica分子，而?a9.1则是在外显子5开始时缺失了1个g，产生一个多态序列和终止密码子。然而一些与mica等位基因相关的gct重复还没有证实，而且分型也摸棱两可，仍在进一步研究中。
1.3mica基因的分子表达
mic基因高度保守，存在于人、灵长类、狗、羊、牛和猪，而小鼠和大鼠不存在。经典的hla?ⅰ类分子广泛分布于人体细胞，但mica分子表达较局限，大量表达在上皮细胞和成纤维细胞的表面，而在角质细胞、单核细胞表面有少量表达，在外周t、b淋巴细胞表面不表达。在人体，mica集中表达在肠道上皮中，其他组织如脑、心脏、肺、胸腺、肝脏、肾脏、皮肤、肾上腺、胎盘、扁桃体和脾脏中都无表达。但目前已经在心、肾和胰腺移植等受体内检出mica特异性抗体，这说明mica产物与器官移植存活有关。此外mica也表达在大多数上皮性肿瘤细胞(胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌及卵巢癌等)中。在有些上皮细胞株中，尽管rna表达的水平相似，但在细胞表面mica分子的表达量很低或检测不到，说明mica存在不同的翻译后加工和转运途径。molinero等[9]研究认为，mica基因翻译起始区存在类似于热休克反应的元件，受到应激后大大增强表达，但受ifn?γ刺激后却不能上调表达。而zou等[10]研究发现接触抑制可以降低成纤维细胞的mica表达，在成纤维细胞快速生长时可以上调mica表达。这可能是对损失的一种应激反应，也可能是控制了mica的rna和蛋白质的合成关闭或启动，这些需要再进一步研究。目前，molinero等[6]已经证实类似于hla?ⅰ类和hla?ⅱ类蛋白，mica分子也是呈共显性表达，而且mica抗原的共显性表达对器官移植抗体所产生的免疫反应有重要的意义[11]。
在外周血单核细胞中，激活的cd4+和cd8+t细胞能够诱导mica表达，这一过程涉及多重反应，同时通过tcr/cd3复合物和cd28共同刺激激活胞内途径，这些胞内途径把t细胞的激活和mica基因的表达联系起来，包括lck和fyn激酶的激活，通过mek1/erk、p38mapk、神经钙蛋白、jak/stats和p70s6激酶途径传递信号。所有的t细胞激活还需要其它转录因子如核因子at、ap?1和核因子kb。核因子kb通过p65(rela)/p50异二聚体和p50/p50同二聚体的复合物调节激活的t淋巴细胞mica的表达，推测核因子kb的结合位点在mica基因的内含子1[9]。
1.4mica基因的功能
最初由于mica分子结构域与经典hla?ⅰ类相似，人们推测它在多态结合与抗原提呈的某些方面发挥作用，但是这种可能性很快被否定，主要是由于mica分子不与β2微球蛋白结合，并且同抗原加工相关转运体(tap)无关，更直接的证据是人们试图从mica蛋白上用酸洗脱mica结合的多肽也没有成功。mica的功能是随着其受体nkg2d、与nkg2d组成复合体dap10的发现之后得到明确的。nkg2d是ⅱ型c凝集素样蛋白，编码基因定位在12p12?p13。一般情况下，nkg2d与dap10蛋白结合以异二聚体形式存在。人nkg2d是一种激活性受体，表达于所有自然杀伤(nk)细胞、γδt细胞、外周的αβcd8+t细胞。虽然表达在t细胞表面，但nkg2d的功能是作为共同刺激分子[12]，有些细胞可以直接被nkg2d激活，如nk细胞和人γδt细胞。nk细胞的活动性是受到激活型和抑制型受体(如nkg2d)的控制，它们的配体(如mica)表达在可能的靶细胞。正常细胞有许多抑制型受体，在这些细胞是一个负反馈调节机制。当受体的配体减少时如细胞转化或感染或激活型受体的配体表达增加，这些细胞就成为nk细胞介导的杀伤作用的靶细胞。
nkg2d受体不仅能够识别mica而且能够识别其它特异的配体。mica?nkg2d复合物在清除感染和癌细胞方面发挥了重要作用[13]。在nkg2d激活后，能触发mica表达细胞株的细胞毒性反应，清除应激或恶性细胞。然而，mica?nkg2d单一结合不能激活胞外细胞毒性的信号，这个过程必需跨膜蛋白dap10[14]。
海南医学院学报vol.15no.4apr.2009由于nkg2d分子的胞质区没有信号转导区域，所以它主要依赖dap10活性信号的转导。dap10分子是pi?3激酶p85亚单位sh2的结合位点，是潜在的sh2功能域，可与磷脂酰肌醇3?激酶(pi?3)的亚单位p85结合，传递活化信号。由此可以推测，mica与nkg2d/dap10结合后，可以将活化信号传递给nk细胞、γδt细胞等，可能有助于促进它们对表达mica分子的肿瘤细胞和移植物的杀伤，参与天然免疫应答。目前，药物阻断nkg2d产生mica抗体途径治疗器官移植排异已经进行动物实验[15]，从而为移植器官排异的治疗提供了一个新的途径。
2mica抗体的临床意义
2.1mica抗体与移植肾排异的关系
mica是细胞和体液免疫应答的多态性分子，作为一个多态性抗原，能够诱导移植肾患者产生特异性抗体[16]和体液免疫导致移植肾不可逆的排异[17]。mica抗体是移植肾排异患者血清异性抗体，是肾移植排异的靶分子[17]。因为在移植肾排异时，可以检测到表达在内皮细胞表面的mica抗原，同时在补体存在的情况下可以杀死靶细胞，也是补体依赖的细胞毒性靶分子[18]。在hla配型相合的排异肾，mica抗体和移植肾排异的关系更明显。移植前预存mica抗体的患者，在移植后的最初3个月移植肾排异将更加普遍。mica抗体和移植肾排异的关系在第一次移植、没有致敏的hla抗体、hla配型完全匹配的移植肾患者中更应关注[19]。目前多篇文献证实mica抗体和急性排异存在明显相关性[20,21]，而且mica抗体的持续存在与慢性移植肾失功有关。amézaga等[22]研究指出，在等待肾移植的患者中检出mica抗体为24.7%，而在肾移植后的患者中为22.7%，在失功的移植肾灌洗液中，含mica抗体移植肾占18.7%，这些数据说明错配的mica等位基因免疫诱导了mica抗体发展，而在失功的移植肾灌洗液中mica特异性抗体的发现暗示移植肾排异的发病机制涉及mica抗体。
由于mica基因表达于上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、激活的单核细胞等细胞，而mica抗体能够在血清补体存在的情况下杀死靶细胞[23]，所以mica抗体通过激活补体损伤内皮细胞，继发内皮细胞及平滑肌细胞增生;也可与内皮细胞结合，刺激内皮细胞增殖,从而使血管内膜逐渐增厚，出现特征性的血管腔缩窄,造成移植肾功能进行性的损害，最终出现移植肾功能丧失。另外，mica抗原在辅t细胞的作用下能够产生特异性mica抗体，mica抗体被识别并使cd8+t细胞增殖，增殖的cd8+t细胞发挥细胞毒作用，导致移植肾失功[19]。
2.2mica抗体与移植肾生存率的关系
目前已有多篇文献报道,虽然hla抗体阳性患者会出现移植肾排异，但mica抗体和hla抗体同时存在时更容易出现移植肾排异，mica抗体和hla抗体之间可能有一定相关性[24]。近来，panigrahi等[25]对185位活体肾移植患者进行随访后认为，mica抗体作为独立因子或同时伴有hla抗体对急性排异的发生率和移植肾的生存率有重要影响。mica抗体阳性与mica抗体和hla抗体均为阴性肾移植患者在急性排异和移植肾生存率方面差异有统计学意义。当mica和hla抗体均为阳性时，急性排异发生率最高和移植物生存率最低。这和mizutani等[26]研究结论基本一致。正是因为mica抗原具有高度多态性，并且表达在内皮细胞表面，因此，mica抗原在移植肾排异过程中是个重要的靶分子。
mica抗体可以降低移植肾的生存率[27]。第13届组织相容性工作组对1329位移植肾有功能的患者进行评估。移植肾4年生存率在mica抗体阳性患者为81.0%，而hla和mica抗体阴性患者为91.4%(p=0.005)。运用生存曲线分析其危险度mica抗体阳性患者为2.04，这和14届组织相容性工作组得出了相同的结论。1286位hla和mica抗体阴性患者1年移植物生存率为98.3%，33位mica抗体阳性患者为85.8%(p=0.0001),mica抗体的存在明显是一个危险因素，危险度达到6.1，同时认为mica抗体和hla抗体之间存在明显相关性(p<0.00002)[28]
eduardo等[11]对196位移植肾患者平均中位随访期为51.4个月(4.3～176.3个月)进行抗体研究[29]。在移植肾生存方面，hla和mica抗体阳性患者和阴性患者存在明显区别(p=0.001)，而hla或mica抗体之间没有明显差别。此外，这些患者在随访期间最相关的因素之一是在明确抗体类型后要分析肾功能2年。很明显在hla和mica抗体阳性患者中肾功能恶化的标志很多，如hla抗体、mica抗体、hla和mica抗体。这些暗示了表达在移植肾血管内皮细胞的抗体(hla和mica)产生双重危害比单一抗体(hla或mica)导致移植物更快和更严重的功能恶化。所以，肾移植后不仅要检测hla抗体而且也要检测mica抗体，并且mica抗体成为肾移植患者的预测预后重要标志物，与terasaki等[27]对移植物生存率的前瞻性研究结果基本一致。故建议肾移植后不仅要检测hla，而且还要检测mica抗体，如果检测到了抗体应该检测抗体的特异性和抗体水平，同时检测患者的肌酐水平[29]。
目前检测hla抗体的技术有补体依赖性细胞毒方法(cdc)、普通流式细胞仪(fcxm)、酶联免疫吸附测定方法(elisa)、免疫磁珠流式细胞仪(luminex)，而mica抗体的检测技术有elisa和luminex方法。luminex方法敏感高、特异性强，而且具有重复性好等优点，所以是检测mica抗体的首选方法，并且首先运用于肾移植患者的mica抗体检测[23]。目前，luminex方法可以检测10种mica等位基因[11]。
2.3mica抗体与移植肾病理的关系
hankey等[30]用mica单克隆抗体间接免疫组织化学的方法评估了mic在肾和胰腺移植活检中的表达。免疫组织化学方法检测表明，全部肾小管坏死或急性排异、大多数的急、慢性排异和慢性排异中有mic表达,正常肾组织中则没有。在胰腺移植也有同样的结果。这些基因产物的细胞表达和细胞受损相关的条件之间显示了很好的相关性，这些结果可以很好的解释这些分子与细胞应激有关。
相反，mica在seiler等[31]研究的肾移植中的表达并没有被证实。他们在病理证实的移植肾排异期间观察到nkg2d能诱导许多mrna。在慢性肾病患者的肾活检中可以检测到高水平的nkg2d转录体，并且比cd3mrna测量法更高的敏感性和特异性，分析细胞毒性效应的指标以t细胞增殖或颗粒酶b和粒容素mrna为标志。
体液免疫促进移植物排异的发病机制研究前景非常广阔。c4d在管周毛细血管的沉积与体液免疫有关，免疫复合物c4d沉积在管周毛细血管已经证实与移植肾排异相关性非常高[24，32]，而且已经成为banff97的诊断标准。在一些hla抗体阴性的排异肾活检中有c4d沉积，提示mica抗体可能参与其中[17]。在体外实验中mica抗体可以激活补体，但在移植肾活检病理中mica抗体的单独存在与补体c4d在管周毛细血管沉积并不存在相关性，在hla抗体阴性而mica抗体阳性移植肾患者中，其排异肾的活检病理所见与补体介导的损伤是一致的[11]。theruvath等[33]和ozawa等[28]用fk506(它莫昔芬)和骁悉治疗慢性移植肾排异患者时发现可降低c4d的沉积和mica抗体的滴度，从而稳定了移植肾功能和延缓了移植肾排异。
综上所述，mica抗体是在肾移植排异过程中存在着体液性成分的指标。其检测对于排异的诊断、治疗都有明显的指导意义，且可以预测预后，所以，临床上肾移植患者检测mica抗体具有很高的实际价值，值得临床推广应用。
【参考文献】
1flegelwa.willmicaglitterforrecipientsofkidneytransplants[j]?newengjmed,2007,357:1337?1339.
2bahrams，bresnahanm，geraghtyde，etal.asecondlineageofmammalianmajorhistocompatibilitycomplexclassigenes[j].procnatlsciusa,1994,91(14)：6259?6263.
3lip，williest，bauers，etal.crystalstructureofthemhcclassihomologmic?a，agammadeltatcellligand[j].immunity,1999,10(5)：577?584.
4grohv,bahrams,bauers,etal.cellstress?regulatedhumanmajorhistocompatibilitycomplexclassigeneexpressedingastrointestinalepithelium[j].procnatlsciusa,1996,93(22)：12445?12450.
5zouy,hanm,wangz,etal.micaallele?leveltypingbysequence?basedtypingwithcomputerizedassignmentofpolymorphicsitesandshorttandemrepeatswithinthetransmembraneregion[j].humimmunol,2006,67(3)：145?151.
6zwirnernw,molineroll,marcoscy,etal.codominantexpressionofthepolymorphicmicaalloantigensencodedbygenesinthehlaregion[j].eurjimmunogenet,2002,29(4)：315?319.
7fodiln,lalouxl,wannerv,etal.allelicrepertoireofthehumanmhcclassimicagene[j].immunogenetics,1996,44(5)：351?357.
8fengml,guoxj,zhangjy,etal.studyonthehaplotypesofmicaandmicbmicrosatelliteandhla?blocusintheguangzhouhanpopulation[j].tissueantigens,2004,64(3)：281?285.
9molineroll,domaicaci,fuertesmb,etal.intracellularexpressionofmicainactivatedcd4tlymphocytesandprotectionfromnkcellmediatedmica?dependentcytotoxicity[j].humimmunol,2006,67(3)：170?182.
10zouy,mirbahaf,stastnyp.contactinhibitioncausesstrongdown?regulationofexpressionofmicainhumanfibroblastsanddecreasednkcellkilling[j].humimmunol,2006,67(3)：183?187.
11eduardol,morales?buenrostrole,alberúj.anti?majorhistocompatibilitycomplexclassi?relatedchainaantibodiesinorgantransplantation[j].transplantationreviews,2008,22(1)：27?38.
12ehrlichli,ogasawarak,hamermanja,etal.engagementofnkg2dbycognateligandorantibodyaloneisinsufficienttomediatecostimulationofhumanandmousecd8+tcells[j].jimmunol,2005,174(4)：1922?1931.
13grohv,rhinehartr,randolph?habeckerj,etal.costimulationofcd8alphabetatcellsbynkg2dviaengagementbymicinducedonvirus?infectedcells[j].natureimmunology,2001,2(3)：255?260.
14wuj,songy,bakkerab,etal.anactivatingimmunoreceptorcomplexformedbynkg2danddap10[j].science,1999,285:(5428)：730?732.
15ogasawarak,benjaminj,takakir,etal.functionofnkg2dinnaturalkillercell?mediatedrejectionofmousebonemarrowgrafts[j].natureimmunology,2005,6(9)：938?945.
16hankeykg,drachenbergcb,papadimitrioujc,etal.micexpressioninrenalandpancreaticallografts[j].transplantation,2002,73(2)：304?306.
17zwirnernw,marcoscy,mirbahaf,etal.identificationofmicaasanewpolymorphicalloantigenrecognizedbyantibodiesinseraoforgantransplantrecipients[j].humimmunol,2000,61(9)：917?924.
18masashik,kawatsuneok,yoshikazut,etal.doesmicahaveinfluenceonacuterejectioninkidneytransplantation[j].amjtransplantat,2006,6(suppl.2)：773.
19zouy,mirbahaf,lazaroa,etal.micaisatargetforcomplement?dependentcytotoxicitywithmousemonoclonalantibodiesandhumanalloantibodies[j].humimmunol,2002,63(1)：30?39.
20zouy,stastnyp,süsalc,etal.antibodiesagainstmicaantigensandkidney?transplantrejection[j].newengjmed,2007,357:1293?1300.
21sumitran?holgerssonswh,wilckzekhe,holgerssonj,etal.identificationofthenonclassicalhlamoleculesmica,astargetsforhumoralimmunityassociatedwithirreversiblerejectionofkidneyallografts[j].transplantation,2002,74(2)：268?77.
22amézagan,crespom,lopez?cobosm,etal.relevanceofmicaantibodiesinacutehumoralrejectioninrenaltransplantpatients[j].transplantimmunology,2006,17(1)：39?42.
23zouy,heinemannfm,grosse?wildeh,etal.detectionofanti?micaantibodiesinpatientsawaitingkidneytransplantation,duringthepost?transplantcourse,andineluatesfromrejectedkidneyallograftsbyluminexflowcytometry[j].humimmunol,2006,67(3)：230?237.
24mauiyyedis,crespom,collinsab,etal.acutehumoralrejectioninkidneytransplantation:ii,morphology,immunopathologyandpathologicclassification[j].jamsocnephrol,2002,13(3)：779?787.
25panigrahia,guptan,siddiquija,etal.posttransplantdevelopmentofmicaandanti?hlaantibodiesisassociatedwithacuterejectionepisodesandrenalallograftloss[j].humimmunol,2007,68(5)：362?367.
26mizutanik,terasakip,rosena,etal.serialten?yearfollow?upofhlaandmicaantibodyproductionpriortokidneygraftfailure[j].amjtransplant,2005,5(9)：2265?2272.
27terasakipi,ozawam,castror.four?yearfollow?upofaprospectivetrialofhlaandmicaantibodiesonkidneygraftsurvival[j].amjtransplant,2007,7(2)：408?415.
28ozawam,castror,jarhowl,etal.frequencyofmicaantibodiesobservedposttransplantationandtheeffectofimmunosuppression[j].transplantation,2006,82(1):241?242.
29morales?buenrostrole,rodríguez?romor,deleo?cerrantesc,etal.hlaandmicaantibodies:furtherevidenceoftheirimpactongraftlosstwoyearsaftertheirdetection.in:terasakip,editor.clinicaltransplant2006[m].losangeles(calif)：terasakifoundationlaboratory,2007.207?218.
30hankeykg,drachenbergcb,papadimitrioujc,etal.micexpressioninrenalandpancreaticallografts[j].transplantation,2002,73(2)：304?306.
31seilerm,brabcovai,viklickyo,etal.heightenedexpressionofthecytotoxicityreceptornkg2dcorrelateswithacuteandchronicnephropathyafterkidneytransplantation[j].amjtransplant,2007,7(3)：423?433.
1、了解细胞分化形成组织，理解组织的概念。
2、识别人体和动物的四种基本组织的细胞特征。
3、识别说出绿色开花植物的主要组织。
4、领悟结构和功能相互适应的重要原理。
重难点及关键：
1、重点：细胞分化、组织形成概念的掌握
2、难点：植物和动物的四大基本组织的细胞特征、功能
教学过程：
一、创设情境
生物体生命活动的基本单位是什么？人是由一个细胞――受精卵发育而来的。一个细胞是怎样变成一个人呢？通过细胞分裂，可以使细胞数目增多，但细胞分裂的结果是一个细胞变成两个相同的细胞，而组成人体的细胞都一样吗？例如神经细胞、肌肉细胞、骨细胞等等，它们的形状、结构、功能有很大的差异，这是为什么呢？本节课我们就来探讨这些问题。
板书设计：
细胞分化形成组织
（一）、组织的形成及概念
（二）、植物体的主要组织
（三）、人和动物的基本组织――活动“观察人体几种常见的组织”
二、教学过程
1、导入新课，展示课件。
（完成导学案）受精卵经过细胞分裂，1个分裂成2个，2个分裂成4个…逐渐发育成人。
植物体的生长现象与哪些方面有关？
2、探究过程
（一）细胞分裂
教师提示：细胞分裂过程中染色体在细胞中的怎样变化？
（二）细胞成长
细胞生长过程中的主要导致整个细胞体积增大。
（三）细胞分化与组织形成
步骤一：展示细胞分化课件：通过细胞分裂产生新细胞，这些细胞在形态、结构方面都很相似。随着细胞的分裂和生长，后来只有一小部分细胞仍具有分裂能力，大部分细胞失去了分裂能力。这些细胞各自具有什么不同的功能，它们在形态、结构上逐渐发生了变化，分化形成了不同的细胞群，叫组织
结合教科书中的图5―15植物细胞示意图，根、茎、叶表面的一层细胞群，即保护组织，具有保护内部部分的功能；叶、果实的叶肉、果肉，细胞壁薄，液泡大，属于营养组织，具有营养功能；茎、叶脉根等处的导管运输水和无机盐属于疏导组织；那些仍具分裂能力的细胞群属于分生组织，最后这些不同组织组合再一起。总结功能特点。
步骤二：番茄的果皮与果肉，用手摸一摸，用牙咬，尝尝它们的区别何在？表皮具有什么功能，果有什么功能？
步骤三：学生讨论：动物和人体的四种组织的分布，分别具有什么功能？如果你的皮肤不慎被滑破，你会感到疼，会流血。你考虑一下皮肤中可能含有哪几种
组织？
教师：出示人体四种基本组织剪
贴图。
学生：结合教科书中的图5―16人体的基本组织示意图，识别人体的四种组织？区分它们的特点、分布、功能。
步骤四：
细胞分裂：细胞分化形成组织，最后植物体由小长大；人受精卵经细胞分裂，分化，逐渐长成婴儿，慢慢成长为一名中学生，而在他周围是鸡蛋、面包、牛奶、蔬菜等食物。使学生意识到自己成长中对父母的索取，从而唤起学生尊敬父母、孝敬老人的情感意识。
三、课堂小结（引导学生回顾本节课的主要内容：理清思路）
细胞分裂―细胞成长―细胞分化―组织形成；植物的四种组织的分布及功能，动物和人体的四种组织的分布及其功能。
四、总结体会
进入到高一阶段，大家的学习压力都是呈直线上升的，因此平时的积累也显得尤为重要，下面小编给大家分享一些高中生物必修知识，希望能够帮助大家，欢迎阅读!
高中生物必修知识1一、细胞核的功能：是遗传信息库(遗传物质储存和复制的场所)，是细胞代谢和遗传的控制中心;
二、细胞核的结构：
1、染色质：由DNA和蛋白质组成，染色质和染色体是同样物质在细胞不同时期的两种存在状态。
2、核膜：双层膜，把核内物质与细胞质分开。
3、核仁：与某种RNA的合成以及核糖体的形成有关。
4、核孔：实现细胞核与细胞质之间的物质交换和信息交流
最后，希望精品小编整理的高一生物细胞核知识点对您有所帮助，祝同学们学习进步。
【篇二：细胞器】
一、相关概念：
细胞质：在细胞膜以内、细胞核以外的原生质，叫做细胞质。细胞质主要包括细胞质基质和细胞器。
细胞质基质：细胞质内呈液态的部分是基质。是细胞进行新陈代谢的主要场所。
细胞器：细胞质中具有特定功能的各种亚细胞结构的总称。
二、八大细胞器的比较：
1、线粒体：(呈粒状、棒状，具有双层膜，普遍存在于动、植物细胞中，内有少量DNA和RNA内膜突起形成嵴，内膜、基质和基粒中有许多种与有氧呼吸有关的酶)，线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，生命活动所需要的能量，大约95%来自线粒体，是细胞的"动力车间"
2、叶绿体：(呈扁平的椭球形或球形，具有双层膜，主要存在绿色植物叶肉细胞里)，叶绿体是植物进行光合作用的细胞器，是植物细胞的"养料制造车间"和"能量转换站"，(含有叶绿素和类胡萝卜素，还有少量DNA和RNA，叶绿素分布在基粒片层的膜上。
在片层结构的膜上和叶绿体内的基质中，含有光合作用需要的酶)。
3、核糖体：椭球形粒状小体，有些附着在内质网上，有些游离在细胞质基质中。
是细胞内将氨基酸合成蛋白质的场所。
4、内质网：由膜结构连接而成的网状物。
是细胞内蛋白质合成和加工，以及脂质合成的"车间"
5、高尔基体：在植物细胞中与细胞壁的形成有关，在动物细胞中与蛋白质(分泌蛋白)的加工、分类运输有关。
6、中心体：每个中心体含两个中心粒，呈垂直排列，存在于动物细胞和低等植物细胞，与细胞的有丝-有关。
7、液泡：主要存在于成熟植物细胞中，液泡内有细胞液。
化学成分：有机酸、生物碱、糖类、蛋白质、无机盐、色素等。有维持细胞形态、储存养料、调节细胞渗透吸水的作用。
8、溶酶体：有"消化车间"之称，内含多种水解酶，能分解衰老、损伤的细胞器，吞噬并杀死侵入细胞的病毒或病菌。
三、分泌蛋白的合成和运输：
核糖体(合成肽链)内质网(加工成具有一定空间结构的蛋白质)
高尔基体(进一步修饰加工)囊泡细胞膜细胞外
四、生物膜系统的组成：包括细胞器膜、细胞膜和核膜等。
高中生物必修知识2疫失调引起的疾病——过敏反应
⑴、概念：是指已免役的机体在再次接受相同物质的刺激时所发生的反应。
⑵、特点：发作迅速、反应强烈、消退较快。一般不会破坏组织细胞，不引起组织损伤。具有明显的遗传倾向和个体差异。
⑶、过敏源：是指引起过敏反应的物质。如花粉、鱼虾、牛奶、蛋类、室内尘土、青霉素、磺胺、奎宁等。
⑷、过敏症状：
皮肤过敏：红肿、寻麻疹等。
呼吸道过敏：流涕、喷嚏、哮喘、呼吸困难等。
消化道过敏：呕吐、腹痛、腹泻等。
严重过敏：支气管痉挛，窒息，或过敏性休克而死亡。
⑸、过敏反应与典型的体液免疫反应的区别：
过敏反应(免役功能过高)体液免疫反应
激发因素过敏源抗原
反应时机第二次接触过敏源第一次接触抗原
抗体分布吸附在某些细胞表面血清、组织胺、外分泌液
反应结果细胞释放组织胺引发使抗原沉淀或形成细胞集团
免疫的分类：
⑴、非特异性免疫特点：
①、长期进化形成，是免疫的基础。②、具有先天性，生来就有。
③、不具专一性，不具特殊针对性。④、出现快，作用范围广，强度较弱。
⑵、特异性免疫特点：
①、以非特异性免疫为基础。②、具后天性，出生后形成。
③、具专一性，具特殊针对性。④、出现慢，针对性强，强度较强。
高中生物必修知识31、生命系统的结构层次依次为：细胞组织器官系统个体种群群落生态系统
细胞是生物体结构和功能的基本单位;地球上最基本的生命系统是细胞
2、光学显微镜的操作步骤：
对光低倍物镜观察移动视野中央(偏哪移哪)高倍物镜观察：①只能调节细准焦螺旋;②调节大光圈、凹面镜
3、原核细胞与真核细胞根本区别为：有无核膜为界限的细胞核
①原核细胞：无核膜，无染色体，如大肠杆菌等细菌、蓝藻
②真核细胞：有核膜，有染色体，如酵母菌，各种动物
注：病毒无细胞结构，但有DNA或RNA
4、蓝藻是原核生物，自养生物
5、真核细胞与原核细胞统一性体现在二者均有细胞膜和细胞质
6、细胞学说建立者是施莱登和施旺，细胞学说建立揭示了细胞的统一性和生物体结构的统一性。
细胞学说建立过程，是一个在科学探究中开拓、继承、修正和发展的过程，充满耐人寻味的曲折
7、组成细胞(生物界)和无机自然界的化学元素种类大体相同，含量不同
8、组成细胞的元素
①大量无素：C、H、O、N、P、S、K、Ca、Mg
②微量无素：Fe、Mn、B、Zn、Mo、Cu
③主要元素：C、H、O、N、P、S
④基本元素：C
⑤细胞干重中，含量最多元素为C，鲜重中含最最多元素为O
9、生物(如沙漠中仙人掌)鲜重中，含量最多化合物为水，干重中含量最多的
化合物为蛋白质。
10、(1)还原糖(葡萄糖、果糖、麦芽糖)可与斐林试剂反应生成砖红色沉淀;脂肪可苏丹III染成橘黄色(或被苏丹IV染成红色);淀粉(多糖)遇碘变蓝色;蛋白质与双缩脲试剂产生紫色反应
(2)还原糖鉴定材料不能选用甘蔗
(3)斐林试剂必须现配现用(与双缩脲试剂不同，双缩脲试剂先加A液，再加B液)
11、蛋白质的基本组成单位是氨基酸，氨基酸结构通式为NH2—C—COOH，各种氨基酸的区别在于R基的不同
12、两个氨基酸脱水缩合形成二肽，连接两个氨基酸分子的化学键(—NH—CO—)叫肽键
13、脱水缩合中，脱去水分子数=形成的肽键数=氨基酸数—肽链条数
14、蛋白质多样性原因：构成蛋白质的氨基酸种类、数目、排列顺序千变万化，多肽链盘曲折叠方式千差万别
15、每种氨基酸分子至少都含有一个氨基(—NH2)和一个羧基(—COOH)，并且都有一个氨基和一个羧基连接在同一个碳原子上，这个碳原子还连接一个氢原子和一个侧链基因
16、遗传信息的携带者是核酸，它在生物体的遗传变异和蛋白质合成中具有极其重要作用，核酸包括两大类：一类是脱氧核糖核酸，简称DNA;一类是核糖核酸，简称RNA，核酸基本组成单位核苷酸
17、蛋白质功能：
①结构蛋白，如肌肉、羽毛、头发、蛛丝
②催化作用，如绝大多数酶
③运输载体，如血红蛋白
④传递信息，如胰岛素
⑤免疫功能，如抗体
18、氨基酸结合方式是脱水缩合：一个氨基酸分子的羧基(—COOH)与另一个氨基酸分子的氨基(—NH2)相连接，同时脱去一分子水，如图：
HOHHH
NH2—C—C—OH+H—N—C—COOHH2O+NH2—C—C—N—C—COOH
R1HR2R1OHR2
19、DNA与RNA的区别：
20、主要能源物质：糖类
细胞内良好储能物质：脂肪
人和动物细胞储能物：糖原
直接能源物质：ATP
21、糖类：
①单糖：葡萄糖、果糖、核糖、脱氧核糖
②二糖：麦芽糖、蔗糖、乳糖
③多糖：淀粉和纤维素(植物细胞)、糖原(动物细胞)
④脂肪：储能;保温;缓冲;减压
22、脂质：磷脂(生物膜重要成分)
胆固醇、固醇(性激素：促进人和动物生殖器官的发育及生殖细胞形成)
维生素D(促进人和动物肠道对Ca和P的吸收)
23、多糖，蛋白质，核酸等都是生物大分子，组成单位依次为：单糖、氨基酸、核苷酸。
生物大分子以碳链为基本骨架，所以碳是生命的核心元素。
24、细胞内水的存在形式为结合水和自由水
自由水(95.5%)：良好溶剂;参与生物化学反应;提供液体环境;运送营养物质及代谢废物;绿色植物进行光合作用的原料
结合水(4.5%)：组成细胞的成分之一
25、无机盐绝大多数以离子形式存在。
哺乳动物血液中Ca2+过低，会出现抽搐症状;患急性肠炎的病人脱水时要补充输入葡萄糖盐水;高温作业大量出汗的工人要多喝淡盐水。
26、细胞膜主要由脂质和蛋白质，和少量糖类组成，脂质中磷脂最丰富，功能越复杂的细胞膜，蛋白质种类和数量越多;
细胞膜基本支架是磷脂双分子层;细胞膜具有一定的流动性和选择透过性。将细胞与外界环境分隔开
27、细胞膜的功能控制物质进出细胞进行细胞间信息交流
28、植物细胞的细胞壁成分为纤维素和果胶，具有支持和保护作用
29、制取细胞膜利用哺乳动物成熟红细胞，因为无核膜和细胞器膜
30、叶绿体：光合作用的细胞器;双层膜
线粒体：有氧呼吸主要场所;双层膜
核糖体：生产蛋白质的细胞器;无膜
中心体：与动物细胞有丝分裂有关;无膜
液泡：调节植物细胞内的渗透压，内有细胞液
内质网：对蛋白质加工
高尔基体：对蛋白质加工，分泌
31、消化酶、抗体等分泌蛋白合成需要四种细胞器：核糖体，内质网、高尔基体、线粒体。
32、细胞膜、核膜、细胞器膜共同构成细胞的生物膜系统，它们在结构和功能上紧密联系，协调。
维持细胞内环境相对稳定生物膜系统功能许多重要化学反应的位点把各种细胞器分开，提高生命活动效率
核膜：双层膜，其上有核孔，可供mRNA通过结构核仁
33、细胞核由DNA及蛋白质构成，与染色体是同种物质在不同时期的染色质两种状态容易被碱性染料染成深色
功能：是遗传信息库，是细胞代谢和遗传的控制中心
34、植物细胞内的液体环境，主要是指液泡中的细胞液
原生质层指细胞膜，液泡膜及两层膜之间的细胞质
植物细胞原生质层相当于一层半透膜;质壁分离中质指原生质层，壁为细胞壁
35、细胞膜和其他生物膜都是选择透过性膜
自由扩散：高浓度低浓度，如H2O，O2，CO2，甘油，乙醇、苯
协助扩散：载体蛋白质协助，高浓度低浓度，如葡萄糖进入红细胞
36、物质跨膜运输方式主动运输：需要能量;载体蛋白协助;低浓度高浓度，如无机盐、离子、胞吞、胞吐：如载体蛋白等大分子
37、细胞膜和其他生物膜都是选择透过性膜，这种膜可以让水分子自由通过，一些离子和小分子也可以通过，而其他离子，小分子和大分子则不能通过。
38、酶的本质：活细胞产生的有机物，绝大多数为蛋白质，少数为RNA
酶的特性：高效性、专一性(每种酶只能催化一种成一类化学反应)
酶作用条件温和，影响酶活性的条件：温度、pH等。最适温度(pH值)下，酶活性，温度和pH偏高或偏低，酶活性都会明显降低，甚至失活(过高、过酸、过碱)
功能：催化作用，降低化学反应所需要的活化能
结构简式：A—P~P~P，A表示腺苷，P表示磷酸基团，~表示高能磷酸键
全称：三磷酸腺苷
39、ATP与ADP相互转化：A—P~P~PA—P~P+Pi+能量
功能：细胞内直接能源物质
40、细胞呼吸：有机物在细胞内经过一系列氧化分解，生成CO2或其他产物，释放能量并生成ATP过程
高中生物必修知识4一、探索历程(略，见P65-67)
二、流动镶嵌模型的基本内容
磷脂双分子层构成了膜的基本支架
蛋白质分子有的镶嵌在磷脂双分子层表面，有的部分或全部嵌入磷脂双分子层中，有的横跨整个磷脂双分子层
磷脂双分子层和大多数蛋白质分子可以运动糖蛋白(糖被)
组成：由细胞膜上的蛋白质与糖类结合形成。
作用：细胞识别、免疫反应、血型鉴定、保护润滑等。
第三节物质跨膜运输的方式
一、被动运输：物质进出细胞，顺浓度梯度的扩散，称为被动运输。
(1)自由扩散：物质通过简单的扩散作用进出细胞
(2)协助扩散：进出细胞的物质借助载体蛋白的扩散
二、主动运输：从低浓度一侧运输到高浓度一侧，需要载体蛋白的协助，同时还需要消耗细胞内化学反应所释放的能量，这种方式叫做主动运输。
方向、载体、能量、举例
自由扩散、高低、不需要、不需要、水、CO2、O2、N2、乙醇、甘油、苯、脂肪酸、维生素等
协助扩散、高低、需要、不需要、葡萄糖进入红细胞
主动运输、低高、需要、需要、氨基酸、K+、Na+、Ca+等离子、葡萄糖进入小肠上皮细胞
三、大分子物质进出细胞的方式：胞吞、胞吐
高中生物必修知识5第一节物质跨膜运输的实例
一、渗透作用
(1)渗透作用：指水分子(或其他溶剂分子)通过半透膜的扩散。
(2)发生渗透作用的条件：
①是具有半透膜
②是半透膜两侧具有浓度差。
二、细胞的吸水和失水(原理：渗透作用)
1、动物细胞的吸水和失水
外界溶液浓度
外界溶液浓度>细胞质浓度时,细胞失水皱缩
外界溶液浓度=细胞质浓度时,水分进出细胞处于动态平衡
2、植物细胞的吸水和失水
细胞内的液体环境主要指的是液泡里面的细胞液。
原生质层：细胞膜和液泡膜以及两层膜之间的细胞质
外界溶液浓度>细胞液浓度时,细胞质壁分离
外界溶液浓度
外界溶液浓度=细胞液浓度时就，水分进出细胞处于动态平衡
、中央液泡大小、原生质层位置、细胞大小
蔗糖溶液、变小、脱离细胞壁、基本不变
清水、逐渐恢复原来大小、恢复原位、基本不变
1、质壁分离产生的条件：
(1)具有大液泡
(2)具有细胞壁
(3)外界溶液浓度>细胞液浓度
2、质壁分离产生的原因：
内因：原生质层伸缩性大于细胞壁伸缩性
外因：外界溶液浓度>细胞液浓度
1、植物吸水方式有两种：
(1)吸帐作用(未形成液泡)如：干种子、根尖分生区
(2)渗透作用(形成液泡)
一、物质跨膜运输的其他实例
1、对矿质元素的吸收
逆相对含量梯度——主动运输
对物质是否吸收以及吸收多少，都是由细胞膜上载体的种类和数量决定。
2、细胞膜是一层选择透过性膜，水分子可以自由通过，一些离子和小分子也可以通过，而其他的离子、小分子和大分子则不能通过。
二、比较几组概念
扩散：物质从高浓度到低浓度的运动叫做扩散(扩散与过膜与否无关)
、(如：O2从浓度高的地方向浓度低的地方运动)
渗透：水分子或其他溶剂分子通过半透膜的扩散又称为渗透
、(如：细胞的吸水和失水，原生质层相当于半透膜)
半透膜：物质的透过与否取决于半透膜孔隙直径的大小
、(如：动物膀胱、玻璃纸、肠衣、鸡蛋的卵壳膜等)
【关键词】角膜缘干细胞；回顾性研究；进展
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1004-4949（2013）06-35-02
干细胞研究被誉为新世纪生物和医学技术领域可能取得革命性突破的项目，20世纪80年代角膜缘干细胞理论确立，在角膜缘干细胞研究中产生了一些新概念，角膜缘干细胞广泛应用于眼表疾病的治疗，角膜缘干细胞研究成为眼科界近年来发展较快的领域之一。本文对近年来在角膜缘干细胞研究方面的新进展进行综述。
1角膜缘干细胞治疗眼表疾病的机制
角膜缘干细胞是位于角膜缘基底上皮层的特殊细胞。角膜缘干细胞的高增殖潜力在角膜上皮的修复中具有重要作用，角膜缘干细胞为角膜上皮更新和修复之来源，角膜上皮有由周边向中心移动的特性。角膜上皮的更新是通过一种从角膜缘向角膜中央的向心性运动来完成的，上皮再生的源头位于角膜缘，角膜上皮的更新和创伤修复来源于角膜缘基底层的干细胞增生和分化。角膜缘有丰富的Ⅳ型胶原纤维，该纤维仅存在于结膜和角膜缘基底膜，是构成干细胞增生分化局部微环境的重要组成部分。
2角膜缘干细胞移植
2.1自体角膜缘干细胞移植：随着人们对角膜缘及其干细胞研究的进展，实验表明在促进眼表面愈合、减少角膜新生血管长入和假性胬肉形成方面，角膜缘移植明显优于球结膜移植，这进一步证明角膜缘移植的有效性。该手术多是将自体健眼角膜缘部组织片移植到患眼角膜缘部受损区，自体角膜缘上皮移植不仅能为病变区角膜缘提供健康的上皮来源，使角膜恢复正常透明性，而且可为病变区结膜和巩膜组织提供正常的角膜缘干细胞，有效的阻止异常结膜源性组织增生，达到重建正常组织和牢固的角膜上皮层之目的，减少并发症，提高视功能，自体移植不存在免疫排斥，成功率高[1]。
2.2同种异体角膜缘干细胞移植：自体角膜缘干细胞移植只对单侧眼表疾病者适用，而对那些双眼眼疾者不适用，角膜缘丰富的血管和淋巴细胞，使角膜缘不再是免疫赦免区，成人角膜HLA-DR抗原主要分布于角膜下及其基质深层，且HLA-DR抗原在角膜移植排斥反应中起主要作用，角膜缘为免疫排斥的高危区域。Tan等[2]在异体角膜缘移植术前术后使用了免疫抑制剂同种异体角膜缘移植获得成功。近年来不断有新的免疫抑制药物出现，免疫排斥仍是异体角膜缘移植面临的最大难题。
2.3培养角膜缘干细胞移植
2.3.1自体角膜缘干细胞培养后移植。
近年来，随着角膜缘干细胞培养技术的成熟，将角膜缘干细胞体外培养后异体移植成为另一研究热点。Lindberg等[3]体外培养角膜缘干细胞，并成功地移植到裸鼠皮下，并牢固地粘附在植床上；Pellaegrini等[4]用自体健眼1mm×1mm×1mm角膜缘干细胞组织块经体外培养扩增后，借助软性角膜接触镜的辅助，移植到患眼上，成功地实现了眼表重建。自体角膜缘干细胞培养后移植不仅解决了自体干细胞来源不足的问题，而且避免了同种异体间移植后的排斥反应。被认为是目前最有前途的治疗方法。除此之外，有专家用人羊膜为支架，成功进行了人自体培养的角膜缘干细胞移植，治疗干细胞缺乏的眼表疾病；还有专家行角膜缘干细胞羊膜片移植治疗角膜缘功能障碍。这些研究证实，培养自体角膜缘干细胞移植提供了一种极好的技术来重建眼表，没有排异反应，供体眼角膜缘少量取材，不损伤干细胞群及角膜，细胞体外培养和扩增技术提供供体细胞来源。
2.3.2异体角膜缘干细胞培养后移植。
潘志强等[5]以人羊膜为载体，分别将原代培养的人角膜缘干细胞接种在羊膜上面，然后把含有干细胞的羊膜片分别移植到化学烧伤或热烧伤后有角膜新生血管形成的人眼角膜上，角膜干细胞羊膜移植术后，移植片在受体植床上能够存在并与巩膜和结膜完全融合为一体，羊膜逐渐被受体组织吸收，角膜透明度增加，基质炎性浸润减轻，上皮光滑，角膜新生血管减少，视力不同程度的提高，这说明移植的角膜干细胞在受体角膜中存活并进行正常增殖和分化形成角膜上皮细胞。临床观察中未发现明显的排斥反应，异体角膜缘干细胞培养后移植目前已取得了一定的效果，它给临床上双眼角膜缘干细胞不同程度功能障碍病人带来曙光。至于植后是否会出现排斥反应等一系列问题都有待于进一步的研究。
4角膜缘干细胞移植进展与发展趋势
角膜缘干细胞移植已成为目前眼科研究一大热点，随着多学科交叉、现代生物技术的发展，角膜缘干细胞的定位、分离、培养问题已经得到解决，人工角膜的研究已经取得了实质性进展。在国外已有多型人工角膜应用于临床，在治疗难治性角膜病变方面显示出越来越多的优越性。虽然还有相当多的问题亟待解决。一旦培养的角膜干细胞移植术成功，就不仅解决了角膜缘移植材料供应不足的问题，而且用自体组织来源的角膜缘干细胞进行移植可以消除移植排斥反应的发生。可以预见在不久的将来，离体培养的角膜缘干细胞将为那些角膜缘功能衰竭患者带来希望，并且为临床眼用药物筛选提供细胞模型，具有广阔的应用前景。
参考文献
[1]黄胜，张娅萍，丁田等.自体角膜缘干细胞移植治疗角膜缘功能衰竭症[J].眼科新进展，2004.
[2]TanDT，FickerLA，BuckleyRJ.Limbaltransplantation[J].Ophthalmology，1996；103（1）：29-36.
[3]LindbergK，BrownME，ChavesHV，KenyonKR，RheinwaldJG.Invitropropagationofhumanocularsurfaceepithelialcellsfortransplantation[J].InvestophthalmolVissci，1993；34（9）：2672.
随着肾移植技术的日趋成熟，现已成为治疗终末肾病最有效的方法。但排异导致的移植肾失功常常成为肾移植失败的最大障碍。移植前后HLA抗体的存在与移植肾排异和失功有关。然而，HLA抗体阴性的移植肾患者同样发生移植肾排异，提示可能有非HLA抗体在超急性、急性和移植肾失功发挥了重要作用。对于HLA抗体阴性的患者，如何确定排异及排异的类型对于排异的控制及预测其预后都是至关重要的问题，而MICA(MHCClass1ChainrelatedA，主要组织相容性Ⅰ类相关链A位点)抗体在这方面有着明显的应用价值，移植前体内预存MICA抗体不仅是急性排斥的因素之一，而且与移植后慢性排斥和移植肾功能减退相关，清除体内预存的MICA抗体有利于移植成功[1]。近年来，MICA抗体逐渐成为人们研究的热点。本文旨在讨论MICA抗体的特性、检测方法及其临床意义，并就其研究进展进行综述。
1MICA特性
1.1MICA的基因和分子结构
1994年首先报道了位于6号染色体的MHCI链相关基因(MIC)[2]。目前，人类MHC基因图谱已经研究确定有7个MIC基因(MICAMICG)，其中只有MICA和MICB编码、表达、转录，MICC，MICD，MICE，MICF和MICG是假基因。MICA和MICB分别位于HLAB着丝粒段46.4Kb和141.2Kb。MICA编码383～389个氨基酸的膜结合蛋白，MICB编码383个氨基酸，而且两者有83%的蛋白类似。这些基因编码分子量为62kd的细胞表面糖蛋白。MICA(11.7Kb)和MICB(12.9Kb)基因的组成分析表明这些基因的长度要比MHCI类分子长，如HLAB。1999年，Spie's和RolandStrong研究小组通过MICA产物晶体结构的详细分析，推测出MIC分子构象。X射线衍射和蛋白晶体分子模型分析显示了MICA和经典HLAⅠ分子的相似性和差异性。最显著的差异在于MICA分子α2功能域有一个明显无序的多肽结构，导致在晶体结构中有一个不可见的易弯曲的环(loop)[3]，Loop结构可能在MICA与其受体结合时发挥重要作用。MICA、MICB位于HLAⅠ类基因区靠近Ⅰ类基因一侧，MIC的区域结构类似于经典HLA-Ⅰ类分子，3个胞外区(α1、α2、α3)、一个跨膜区、一个胞质尾区，但与HLAⅠ类基因同源性较差，仅28%～30%，而MICA、MICB之间同源性有84%。MICs的分子折叠、结构稳定性及其在细胞表面的表达均不需要结合抗原肽，也不需β2微球蛋白的辅助。因为它们是膜结合抗原，并且只表达在缺少β2微球蛋白的细胞表面[4]。其次从晶体结构上看，MICA虽然也有如经典Ⅰ类分子样的α1、α2、α3功能区，但是其空间结构发生了较大变化。虽然α1、α2也可形成抗原结合槽样结构，但其仅能容纳小于3～4个氨基酸残基，这提示MICs不能结合抗原肽。α3与α2、α1间的连接肽易于伸展，从而使各功能区之间更富变动性，这也是MICs较为独特的性质。
1.2MICA基因的多态性
MICA和MICB基因的多态性虽不如经典的HLAI类基因丰富，但亦很高，现已发现有61个MICA等位基因和30个MICB等位基因[5，6]。如果将来对更多的种族检测，等位基因的数量可能进一步增加，但是有3个最普通的等位基因，分别为MICA*00801(>25%)、MICA*00201(>10%)、MICA*004(>10%)。Fodil等在MICA基因外显子24(编码胞外结构域α1α3)的核苷酸序列中共发现有27个核苷酸变异，其中22个是非同义改变(4/6在α1，10/10在α2，8/11在α3)，在α1α3中共有16个MICA等位基因的变异体[7]。MICA分子多态残基分布在整个分子的胞外部分，但在α2结构域中略有优势。此外，日本学者在MICA基因外显子5(编码跨膜区)发现了三核苷酸重复顺序(GCT)n微卫星多态性。到目前为止，检测到该微卫星顺序8个独特的等位基因，分别被称为MICA的﹡A4、﹡A5、﹡A6、﹡A9、﹡A7、﹡A10、﹡A9.1和﹡A5.1等位基因[6，8]。前6个分别代表(GCT)的重复拷贝数为4、5、6、9、7、10，﹡A5.1则是在﹡A5的基础插入1个G，即(GCT)4GGCT。这个(GGCT)序列导致移码突变，在TM区产生一个早期出现的终止密码子，编码一个可溶性的分泌型的MICA分子，而﹡A9.1则是在外显子5开始时缺失了1个G，产生一个多态序列和终止密码子。然而一些与MICA等位基因相关的GCT重复还没有证实，而且分型也摸棱两可，仍在进一步研究中。
1.3MICA基因的分子表达
MIC基因高度保守，存在于人、灵长类、狗、羊、牛和猪，而小鼠和大鼠不存在。经典的HLAⅠ类分子广泛分布于人体细胞，但MICA分子表达较局限，大量表达在上皮细胞和成纤维细胞的表面，而在角质细胞、单核细胞表面有少量表达，在外周T、B淋巴细胞表面不表达。在人体，MICA集中表达在肠道上皮中，其他组织如脑、心脏、肺、胸腺、肝脏、肾脏、皮肤、肾上腺、胎盘、扁桃体和脾脏中都无表达。但目前已经在心、肾和胰腺移植等受体内检出MICA特异性抗体，这说明MICA产物与器官移植存活有关。此外MICA也表达在大多数上皮性肿瘤细胞(胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌及卵巢癌等)中。在有些上皮细胞株中，尽管RNA表达的水平相似，但在细胞表面MICA分子的表达量很低或检测不到，说明MICA存在不同的翻译后加工和转运途径。Molinero等[9]研究认为，MICA基因翻译起始区存在类似于热休克反应的元件，受到应激后大大增强表达，但受IFNγ刺激后却不能上调表达。而Zou等[10]研究发现接触抑制可以降低成纤维细胞的MICA表达，在成纤维细胞快速生长时可以上调MICA表达。这可能是对损失的一种应激反应，也可能是控制了MICA的RNA和蛋白质的合成关闭或启动，这些需要再进一步研究。目前，Molinero等[6]已经证实类似于HLAⅠ类和HLAⅡ类蛋白，MICA分子也是呈共显性表达，而且MICA抗原的共显性表达对器官移植抗体所产生的免疫反应有重要的意义[11]。
在外周血单核细胞中，激活的CD4+和CD8+T细胞能够诱导MICA表达，这一过程涉及多重反应，同时通过TCR/CD3复合物和CD28共同刺激激活胞内途径，这些胞内途径把T细胞的激活和MICA基因的表达联系起来，包括Lck和Fyn激酶的激活，通过MEK1/ERK、P38MAPK、神经钙蛋白、Jak/STATs和p70s6激酶途径传递信号。所有的T细胞激活还需要其它转录因子如核因子AT、AP1和核因子KB。核因子KB通过P65(RelA)/P50异二聚体和P50/P50同二聚体的复合物调节激活的T淋巴细胞MICA的表达，推测核因子KB的结合位点在MICA基因的内含子1[9]。
1.4MICA基因的功能
最初由于MICA分子结构域与经典HLAⅠ类相似，人们推测它在多态结合与抗原提呈的某些方面发挥作用，但是这种可能性很快被否定，主要是由于MICA分子不与β2微球蛋白结合，并且同抗原加工相关转运体(TAP)无关，更直接的证据是人们试图从MICA蛋白上用酸洗脱MICA结合的多肽也没有成功。MICA的功能是随着其受体NKG2D、与NKG2D组成复合体DAP10的发现之后得到明确的。NKG2D是Ⅱ型C凝集素样蛋白，编码基因定位在12p12p13。一般情况下，NKG2D与DAP10蛋白结合以异二聚体形式存在。人NKG2D是一种激活性受体，表达于所有自然杀伤(NK)细胞、γδT细胞、外周的αβCD8+T细胞。虽然表达在T细胞表面，但NKG2D的功能是作为共同刺激分子[12]，有些细胞可以直接被NKG2D激活，如NK细胞和人γδT细胞。NK细胞的活动性是受到激活型和抑制型受体(如NKG2D)的控制，它们的配体(如MICA)表达在可能的靶细胞。正常细胞有许多抑制型受体，在这些细胞是一个负反馈调节机制。当受体的配体减少时如细胞转化或感染或激活型受体的配体表达增加，这些细胞就成为NK细胞介导的杀伤作用的靶细胞。
NKG2D受体不仅能够识别MICA而且能够识别其它特异的配体。MICANKG2D复合物在清除感染和癌细胞方面发挥了重要作用[13]。在NKG2D激活后，能触发MICA表达细胞株的细胞毒性反应，清除应激或恶性细胞。然而，MICANKG2D单一结合不能激活胞外细胞毒性的信号，这个过程必需跨膜蛋白DAP10[14]。
海南医学院学报Vol.15No.4Apr.2009由于NKG2D分子的胞质区没有信号转导区域，所以它主要依赖DAP10活性信号的转导。DAP10分子是PI3激酶p85亚单位SH2的结合位点，是潜在的SH2功能域，可与磷脂酰肌醇3激酶(PI3)的亚单位p85结合，传递活化信号。由此可以推测，MICA与NKG2D/DAP10结合后，可以将活化信号传递给NK细胞、γδT细胞等，可能有助于促进它们对表达MICA分子的肿瘤细胞和移植物的杀伤，参与天然免疫应答。目前，药物阻断NKG2D产生MICA抗体途径治疗器官移植排异已经进行动物实验[15]，从而为移植器官排异的治疗提供了一个新的途径。
2MICA抗体的临床意义
2.1MICA抗体与移植肾排异的关系
MICA是细胞和体液免疫应答的多态性分子，作为一个多态性抗原，能够诱导移植肾患者产生特异性抗体[16]和体液免疫导致移植肾不可逆的排异[17]。MICA抗体是移植肾排异患者血清中特异性抗体，是肾移植排异的靶分子[17]。因为在移植肾排异时，可以检测到表达在内皮细胞表面的MICA抗原，同时在补体存在的情况下可以杀死靶细胞，也是补体依赖的细胞毒性靶分子[18]。在HLA配型相合的排异肾，MICA抗体和移植肾排异的关系更明显。移植前预存MICA抗体的患者，在移植后的最初3个月移植肾排异将更加普遍。MICA抗体和移植肾排异的关系在第一次移植、没有致敏的HLA抗体、HLA配型完全匹配的移植肾患者中更应关注[19]。目前多篇文献证实MICA抗体和急性排异存在明显相关性[20，21]，而且MICA抗体的持续存在与慢性移植肾失功有关。Amézaga等[22]研究指出，在等待肾移植的患者中检出MICA抗体为24.7%，而在肾移植后的患者中为22.7%，在失功的移植肾灌洗液中，含MICA抗体移植肾占18.7%，这些数据说明错配的MICA等位基因免疫诱导了MICA抗体发展，而在失功的移植肾灌洗液中MICA特异性抗体的发现暗示移植肾排异的发病机制涉及MICA抗体。
由于MICA基因表达于上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、激活的单核细胞等细胞，而MICA抗体能够在血清补体存在的情况下杀死靶细胞[23]，所以MICA抗体通过激活补体损伤内皮细胞，继发内皮细胞及平滑肌细胞增生;也可与内皮细胞结合，刺激内皮细胞增殖，从而使血管内膜逐渐增厚，出现特征性的血管腔缩窄，造成移植肾功能进行性的损害，最终出现移植肾功能丧失。另外，MICA抗原在辅助性T细胞的作用下能够产生特异性MICA抗体，MICA抗体被识别并使CD8+T细胞增殖，增殖的CD8+T细胞发挥细胞毒作用，导致移植肾失功[19]。
2.2MICA抗体与移植肾生存率的关系
目前已有多篇文献报道，虽然HLA抗体阳性患者会出现移植肾排异，但MICA抗体和HLA抗体同时存在时更容易出现移植肾排异，MICA抗体和HLA抗体之间可能有一定相关性[24]。近来，Panigrahi等[25]对185位活体肾移植患者进行随访后认为，MICA抗体作为独立因子或同时伴有HLA抗体对急性排异的发生率和移植肾的生存率有重要影响。MICA抗体阳性与MICA抗体和HLA抗体均为阴性肾移植患者在急性排异和移植肾生存率方面差异有统计学意义。当MICA和HLA抗体均为阳性时，急性排异发生率最高和移植物生存率最低。这和Mizutani等[26]研究结论基本一致。正是因为MICA抗原具有高度多态性，并且表达在内皮细胞表面，因此，MICA抗原在移植肾排异过程中是个重要的靶分子。
MICA抗体可以降低移植肾的生存率[27]。第13届组织相容性工作组对1329位移植肾有功能的患者进行评估。移植肾4年生存率在MICA抗体阳性患者为81.0%，而HLA和MICA抗体阴性患者为91.4%(P=0.005)。运用生存曲线分析其危险度MICA抗体阳性患者为2.04，这和14届组织相容性工作组得出了相同的结论。1286位HLA和MICA抗体阴性患者1年移植物生存率为98.3%，33位MICA抗体阳性患者为85.8%(P=0.0001)，MICA抗体的存在明显是一个危险因素，危险度达到6.1，同时认为MICA抗体和HLA抗体之间存在明显相关性(P
Eduardo等[11]对196位移植肾患者平均中位随访期为51.4个月(4.3～176.3个月)进行抗体研究[29]。在移植肾生存方面，HLA和MICA抗体阳性患者和阴性患者存在明显区别(P=0.001)，而HLA或MICA抗体之间没有明显差别。此外，这些患者在随访期间最相关的因素之一是在明确抗体类型后要分析肾功能2年。很明显在HLA和MICA抗体阳性患者中肾功能恶化的标志很多，如HLA抗体、MICA抗体、HLA和MICA抗体。这些暗示了表达在移植肾血管内皮细胞的抗体(HLA和MICA)产生双重危害比单一抗体(HLA或MICA)导致移植物更快和更严重的功能恶化。所以，肾移植后不仅要检测HLA抗体而且也要检测MICA抗体，并且MICA抗体成为肾移植患者的预测预后重要标志物，与Terasaki等[27]对移植物生存率的前瞻性研究结果基本一致。故建议肾移植后不仅要检测HLA，而且还要检测MICA抗体，如果检测到了抗体应该检测抗体的特异性和抗体水平，同时检测患者的肌酐水平[29]。
目前检测HLA抗体的技术有补体依赖性细胞毒方法(CDC)、普通流式细胞仪(FCXM)、酶联免疫吸附测定方法(ELISA)、免疫磁珠流式细胞仪(Luminex)，而MICA抗体的检测技术有ELISA和Luminex方法。Luminex方法敏感高、特异性强，而且具有重复性好等优点，所以是检测MICA抗体的首选方法，并且首先运用于肾移植患者的MICA抗体检测[23]。目前，Luminex方法可以检测10种MICA等位基因[11]。
2.3MICA抗体与移植肾病理的关系
Hankey等[30]用MICA单克隆抗体间接免疫组织化学的方法评估了MIC在肾和胰腺移植活检中的表达。免疫组织化学方法检测表明，全部肾小管坏死或急性排异、大多数的急、慢性排异和慢性排异中有MIC表达，正常肾组织中则没有。在胰腺移植也有同样的结果。这些基因产物的细胞表达和细胞受损相关的条件之间显示了很好的相关性，这些结果可以很好的解释这些分子与细胞应激有关。
相反，MICA在Seiler等[31]研究的肾移植中的表达并没有被证实。他们在病理证实的移植肾排异期间观察到NKG2D能诱导许多mRNA。在慢性肾病患者的肾活检中可以检测到高水平的NKG2D转录体，并且比CD3mRNA测量法更高的敏感性和特异性，分析细胞毒性效应的指标以T细胞增殖或颗粒酶B和粒容素mRNA为标志。
体液免疫促进移植物排异的发病机制研究前景非常广阔。C4d在管周毛细血管的沉积与体液免疫有关，免疫复合物C4d沉积在管周毛细血管已经证实与移植肾排异相关性非常高[24，32]，而且已经成为Banff97的诊断标准。在一些HLA抗体阴性的排异肾活检中有C4d沉积，提示MICA抗体可能参与其中[17]。在体外实验中MICA抗体可以激活补体，但在移植肾活检病理中MICA抗体的单独存在与补体C4d在管周毛细血管沉积并不存在相关性，在HLA抗体阴性而MICA抗体阳性移植肾患者中，其排异肾的活检病理所见与补体介导的损伤是一致的[11]。Theruvath等[33]和Ozawa等[28]用FK506(它莫昔芬)和骁悉治疗慢性移植肾排异患者时发现可降低C4d的沉积和MICA抗体的滴度，从而稳定了移植肾功能和延缓了移植肾排异。
综上所述，MICA抗体是在肾移植排异过程中存在着体液性成分的指标。其检测对于排异的诊断、治疗都有明显的指导意义，且可以预测预后，所以，临床上肾移植患者检测MICA抗体具有很高的实际价值，值得临床推广应用。
参考文献
1FlegelWA.WillMICAglitterforrecipientsofkidneytransplants[J]?NewEngJMed，2007，357:13371339.
2BahramS，BresnahanM，GeraghtyDE，etal.AsecondlineageofmammalianmajorhistocompatibilitycomplexclassIgenes[J].ProcNatlSciUSA，1994，91(14)：62596263.
3LiP，WillieST，BauerS，etal.CrystalstructureoftheMHCclassIhomologMICA，agammadeltaTcellligand[J].Immunity，1999，10(5)：577584.
4GrohV，BahramS，BauerS，etal.CellstressregulatedhumanmajorhistocompatibilitycomplexclassIgeneexpressedingastrointestinalepithelium[J].ProcNatlSciUSA，1996，93(22)：1244512450.
5ZouY，HanM，WangZ，etal.MICAalleleleveltypingbysequencebasedtypingwithcomputerizedassignmentofpolymorphicsitesandshorttandemrepeatswithinthetransmembraneregion[J].HumImmunol，2006，67(3)：145151.
6ZwirnerNW，MolineroLL，MarcosCY，etal.CodominantexpressionofthepolymorphicMICAalloantigensencodedbygenesintheHLAregion[J].EurJImmunogenet，2002，29(4)：315319.
7FodilN，LalouxL，WannerV，etal.AllelicrepertoireofthehumanMHCclassIMICAgene[J].Immunogenetics，1996，44(5)：351357.
8FengML，GuoXJ，ZhangJY，etal.StudyonthehaplotypesofMICAandMICBMICrosatelliteandHLABlocusintheGuangzhouHanpopulation[J].TissueAntigens，2004，64(3)：281285.
9MolineroLL，DomaicaCI，FuertesMB，etal.IntracellularexpressionofMICAinactivatedCD4TlymphocytesandprotectionfromNKcellmediatedMICAdependentcytotoxicity[J].HumImmunol，2006，67(3)：170182.
10ZouY，MirbahaF，StastnyP.ContactinhibitioncausesstrongdownregulationofexpressionofMICAinhumanfibroblastsanddecreasedNKcellkilling[J].HumImmunol，2006，67(3)：183187.
11EduardoL，MoralesBuenrostroLE，AlberúJ.AntimajorhistocompatibilitycomplexclassIrelatedchainAantibodiesinorgantransplantation[J].TransplantationReviews，2008，22(1)：2738.
12EhrlichLI，OgasawaraK，HamermanJA，etal.EngagementofNKG2DbycognateligandorantibodyaloneisinsufficienttomediatecostimulationofhumanandmouseCD8+Tcells[J].JImmunol，2005，174(4)：19221931.
13GrohV，RhinehartR，RandolphHabeckerJ，etal.CostimulationofCD8alphabetaTcellsbyNKG2DviaengagementbyMICinducedonvirusinfectedcells[J].NatureImmunology，2001，2(3)：255260.
14WuJ，SongY，BakkerAB，etal.AnactivatingimmunoreceptorcomplexformedbyNKG2DandDAP10[J].Science，1999，285:(5428)：730732.
15OgasawaraK，BenjaminJ，TakakiR，etal.FunctionofNKG2Dinnaturalkillercellmediatedrejectionofmousebonemarrowgrafts[J].NatureImmunology，2005，6(9)：938945.
16HankeyKG，DrachenbergCB，PapadimitriouJC，etal.MICexpressioninrenalandpancreaticallografts[J].Transplantation，2002，73(2)：304306.
17ZwirnerNW，MarcosCY，MirbahaF，etal.IdentificationofMICAasanewpolymorphicalloantigenrecognizedbyantibodiesinseraoforgantransplantrecipients[J].HumImmunol，2000，61(9)：917924.
18MasashiK，KawaTsuneoK，YoshikazuT，etal.DoesMICAhaveinfluenceonacuterejectioninkidneytransplantation[J].AmJTransplantat，2006，6(Suppl.2)：773.
19ZouY，MirbahaF，LazaroA，etal.MICAisatargetforcomplementdependentcytotoxicitywithmousemonoclonalantibodiesandhumanalloantibodies[J].HumImmunol，2002，63(1)：3039.
20ZouY，StastnyP，SüsalC，etal.AntibodiesagainstMICAantigensandkidneytransplantrejection[J].NewEngJMed，2007，357:12931300.
21SumitranHolgerssonSWH，WilckzekHE，HolgerssonJ，etal.IdentificationofthenonclassicalHLAmoleculesMICA，astargetsforhumoralimmunityassociatedwithirreversiblerejectionofkidneyallografts[J].Transplantation，2002，74(2)：26877.
22AmézagaN，CrespoM，LopezCobosM，etal.RelevanceofMICAantibodiesinacutehumoralrejectioninrenaltransplantpatients[J].TransplantImmunology，2006，17(1)：3942.
23ZouY，HeinemannFM，GrosseWildeH，etal.DetectionofantiMICAantibodiesinpatientsawaitingkidneytransplantation，duringtheposttransplantCourse，andineluatesfromrejectedkidneyallograftsbyluminexflowcytometry[J].HumImmunol，2006，67(3)：230237.
24MauiyyediS，CrespoM，CollinsAB，etal.Acutehumoralrejectioninkidneytransplantation:II，Morphology，immunopathologyandpathologicclassification[J].JAmSocNephrol，2002，13(3)：779787.
25PanigrahiA，GuptaN，SiddiquiJA，etal.PosttransplantdevelopmentofMICAandantiHLAantibodiesisassociatedwithacuterejectionepisodesandrenalallograftloss[J].HumImmunol，2007，68(5)：362367.
26MizutaniK，TerasakiP，RosenA，etal.SerialtenyearfollowupofHLAandMICAantibodyproductionpriortokidneygraftfailure[J].AmJTransplant，2005，5(9)：22652272.
27TerasakiPI，OzawaM，CastroR.FouryearfollowupofaprospectivetrialofHLAandMICAantibodiesonkidneygraftsurvival[J].AmJTransplant，2007，7(2)：408415.
28OzawaM，CastroR，JarhowL，etal.FrequencyofMICAantibodiesobservedposttransplantationandtheeffectofimmunosuppression[J].Transplantation，2006，82(1):241242.
29MoralesBuenrostroLE，RodríguezRomoR，deLeoCerrantesC，etal.HLAandMICAantibodies:furtherevidenceoftheirimpactongraftlosstwoyearsaftertheirdetection.In:TerasakiP，editor.Clinicaltransplant2006[M].LosAngeles(Calif)：TerasakiFoundationLaboratory，2007.207218.
30HankeyKG，DrachenbergCB，PapadimitriouJC，etal.MICexpressioninrenalandpancreaticallografts[J].Transplantation，2002，73(2)：304306.
31SeilerM，BrabcovaI，ViklickyO，etal.HeightenedexpressionofthecytotoxicityreceptorNKG2Dcorrelateswithacuteandchronicnephropathyafterkidneytransplantation[J].AmJTransplant，2007，7(3)：423433.
【关键词】肝移植；排斥反应；免疫耐受；环孢素A
【中图分类号】R617【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)08-0028-02
临床器官移植的长期存活率得到明显提高，已成为终末期器官功能衰竭病人的最佳治疗方案。然而，同种异体排斥反应仍然是器官移植的主要障碍。大鼠肝移植是目前最常用的肝移植动物试验模型，为临床提供了大量宝贵的试验数据，下面是我们利用近交系Lewis和BN大鼠进行肝移植的一组试验数据。
1材料和方法
1.1实验动物
1.1.1供鼠近交系Lewis大鼠，雄性，SPF/VAF，体重200～250g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.1.2受鼠近交系BN大鼠，雄性，SPF/VAF，体重200-250g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。我们采用改进的Kamada等袖套方法建立肝移植模型。动物均在标准条件下饲养。
1.1.3实验为同种异体移植另外各设亚组观察生存期。移植后1、3、5、7、14天切取移植肝脏用于病理学的检测。另外设亚组观察移植后一般情况和肝移植术后受体的存活时间。
1.2实验动物分组、标本采集
1.2.1实验动物分组实验为同种异体移植，分为三个组，另外每组设亚组6只肝移殖大鼠观察移植后一般情况和肝移植术后受体的存活时间。①A组：n=36，同基因移植组（BNBN）；②B组：n=36，异基因移植（LewisBN）+环孢素A（CsA）组；大鼠肝移植后用环孢霉素A（CsA）2.0mg/kg/d皮下注射0-7天；③C组：n=36，异基因移植组（LewisBN），
1.2.2标本采集在移植后1、3、5、7、14天时间段各杀死6只大鼠。取肝组织放入10%中性甲醛固定，制成蜡块并切片，用于排斥反应病理学检查。各个亚组在标准条件下喂养，观察移植鼠的一般生活状态和并记录其存活时间。参照Kemnitze的标准进行急性排斥反应分级:0级无排斥证据；0-1级有排斥倾向，但不足于诊断：轻度的汇管区混合性细胞浸润，胆管损伤，无静脉内皮炎；1级轻度急性排斥：汇管区轻度单个核细胞浸润，以淋巴细胞为主，部分可见混合性细胞。汇管区或/和中央静脉区可见静脉内皮炎；肝实质细胞坏死可以见到，10%以上的肝实质区域可见单个核细胞浸润，胆管损伤；2级中度急性排斥：汇管区可见更明确的单个核细胞浸润，肝实质细胞退行性改变。部分区域可见非桥接性坏死，肝实质区域可见混合性细胞浸润，以单个核细胞为主，约占整个肝实质区的10-30%，汇管区和中央静脉内皮炎，胆管损伤；3级重度急性排斥：汇管区和肝实质区可见明显的混合性细胞浸润，以单个核细胞为主，30%以上的整个肝实质区有明确的退行性变和坏死，部分为桥接坏死，汇管区和中央区静脉内皮炎，胆管损伤。
1.2.3统计学处理实验所得数据以±s表示，统计学处理用spss11.0软件完成。各组肝移殖受体存活率评估以Kaplan-Meier法检验，其它参数作One-wayANOVA分析及q检验，P
2结果
2.1各组大鼠术后一般状态及生存时间。见图1。A组及B组分别和C组比较，P
全部受者均于术后0.5-1小时内苏醒，一般1-3小时后可进水、一天后进食。A组，七天后皮毛正常，体重增加，均长期存活，（大于100天）。C组大鼠皮毛灰暗，进食差，体重进行性减轻，术后28-38天全部死亡，中位存活时间33.3天。B组大鼠，6只中4只获得长期存活，用药期间一般状态差，进食少，体重不增加，但停药后好转，精神状态逐日好转，活动增加，生存时间明显延长，平均生存时间大于100天；A组和B组分别与C组比较，P
2.2移植肝病理表现及排斥分级见图2。
A组供肝各个时间段病理学检查(附图3-1)，部分汇管区有少量炎性细胞浸润，术后第3天和第5天分级为0.18和0.19级，其他时间段均为0。B组(附图3-2)第1天未见有排斥表现，第3天可见淋巴细胞浸润，平均排斥分级分别为0.48,第5、7天淋巴细胞细胞浸润更加明显，平均排斥分级分别为0.67和1.10,14天淋巴细胞浸润，胆管增生存在，平均排斥分级1.16。C组(附图3-3)供肝术后第1天汇管区有少量炎性细胞浸润，可见门静脉和中央静脉内皮肿胀，未见排斥发生，术后第3天汇管区淋巴细胞细胞浸润明显，可见肝实质变性，平均排斥分级1.59级，术后第5天中度排斥表现，平均排斥分级为2.34级术后第7天和14天，出现严重急性排斥表现，静脉内皮炎明显，大量炎性细胞浸润，可见肝的变性坏死，胆管内皮炎或小小胆管消失，平均排斥分级分别为2.87和2.93；除第1天外，B组各时间段的排斥分级明显高于A组，差别显著（P
3讨论
本实验研究表明同基因大鼠肝移植，移植肝不发生急性排斥反应，受鼠术后生存状况良好。此实验结果再一次为临床移植提供理论依据，同卵双生个体之间进行器官移植不会发生排斥反应，是最理想的供受体结合。但是这样的移植机会很少，所以尽量选择基因配型相近的供受体是临床移植努力争取的。同种异体之间进行器官移植是临床最常见的，由于非同基因之间进行移植，急性排斥反应是不可回避的难题，C组的实验结果进一步证明了急性排斥反应的发生，会造成受体内移植物结构的破坏，生活质量的下降和生命的短期丧失。所以，抑制急性排斥反应，诱导机体抗原特异性免疫耐受，是解决器官移植排斥的根本方法。我国肝移植发展迅猛，大鼠肝移植模型将为肝移植的基础和临床研究提供重要的实验手段。Lewis-BN大鼠肝移植是国际上通用的、用来研究急性排斥反应的动物模型。在本试验中，C组，第3天排斥分级较A组明显升高，两者比较P
短期应用小剂量CsA能使排斥的大鼠肝移植导致耐受或者长期接受。CsA使多种移植模型达到长期接受或耐受的机理与其参与了多方面的免疫作用有关。CsA抑制已接触抗原的CTL产生，其受体为环孢素结合蛋白(cyclophilin)；在基因水平，CsA抑制IL-2和IFN-γ生成与释放，IL-2是T细胞存活、分化、增殖的生长因子，IFN-γ是促进Th1细胞分化的关键性因子；Khanna等报道，CsA能刺激转化生长因子β(TGF-β)基因启动子的活性，从而使TGF-β表达增高；据报道，在体内或体外给予CsA，以NF-κB为目标靶，可抑制NF-κB核移位，从而抑制树突状细胞(DC)的成熟。成熟的DC则在同种移植物排斥反应中起关键作用；未成熟的DC则能延长移植器官存活。本研究应用近交系大鼠Lewis作为供体，BN大鼠作为受体实行原位肝移植，从0～7天给予CsA2mg/kg/d,结果证明CsA能使受体BN的平均生存期明显延长，多数大于100天，而没有应用CsA的C组的平均生存期仅为33天，两组的生存率比较有明显的差别，P
参考文献
[1]KamadaN,CalneRY.Asurgicalexperiencewithfivehundredthirtylivertransplantsintherat[J].Surgery,1983,Jan;93(1Pt1):64-69.
摘要目的:本文对新研制的聚β羟基丁酯(PHB)这一生物可降解材料进行细胞相容性研究。方法:采用L929小鼠成纤维细胞,经材料高温浸提液、常温浸出液与L929细胞接触及直接在PHB膜片上种植该细胞,运用四唑盐比色法(MTTassay)测定其1,3,5天L929细胞的相对增殖率及其毒性程度。结果:PHB材料在高温及常温下物理、化学性质稳定。结论:PHB细胞相容性好,细胞毒性程度0级。
关键词PHB生物降解材料细胞相容性比色法
THEEVALUATIONATTHECYTOTOXITYOFPOLY-β-HYDROXYBUTYRATEATTHEFIBROBLASTSOFMICEINVITRO
TangSuyang,AiYufeng,DongZhaolin,etal
ChinesePLA205Hospital(Jingzhou121000)
AbstractAin:ApplicationofMTTassaytoevaluatethecytotoxityofpoly-3-hydroxybutgrateatthefibroblastsofmice.Methods:ApplicaiohtionlogarithmicgrowthofL929cellsofmiceimplantinginthedifferentcnditionsofPHBtomeasuretherelatiegrowthrateat1,3,5days.Results:PHBisstableathighandnormaltemperature.Conclusion:PHBhavegoodcytocompatibilityandnearlynocytotoxity.
KeywordsPoly-βhydroxybutyratebiodegradablematerialsCytocompatibilityMTT
聚β羟基丁酯(Poly-βhydroxybutyrate简称PHB)是由微生物产生的聚酯,1927年由法国MLemoigne首次从巨大芽孢杆菌(Bacillusmegatherium)提取得到。它具有高熔点、高结晶度、高分子量的特点,拉伸程度与聚丙烯大致相同,而且PHB更耐紫外线,不易引起炎症,生物相容性好;由于其由微生物制造,完全不含有重金属等有毒物质,是极洁净的生物塑料[1]。它在生物体内可以完全降解,它的最终产物是β羟基丁酸、二氧化碳和水,因此,可做为新的生物医学材料。英国ICI公司已研制PHB作为无须拆除的外科缝线,商品名为Biopol,该材料在创伤外科、整形外科、美容外科等外科领域及在药学领域方面有着广泛的应用前景,如外科可吸收缝线,软组织植入、骨固定材料、神经修复、抗青光眼手术、药物缓释系统等。目前国内对于PHB材料的生物相容性研究方面未有报道,本文对新研制的国产聚羟基丁酯进行细胞毒性的实验研究,评价该材料的细胞相容性。
1材料与方法
1.1聚β羟基丁酯膜片(
1.2浸提液制备
1.2.1高温浸提液的制备将聚β羟基丁酯膜片、二醋酸二丁基锡析聚氯乙烯膜片各2cm2,经过清洁洗涤,75%酒精洗两次,再加10倍量蒸馏水摇洗,两次沥干,加生理盐水20ml,置于121℃容器中浸提1小时。
1.2.2常温浸出液制备分别将聚β-羟基丁酯、二醋酸二丁基锡析聚氯乙烯膜片用清洁洗涤消毒,分别加入含有10%胎牛血清的RPMI164020ml培养在5%CO2和95%空气、37℃培养箱内24小时后取出膜片。
1.2.3将聚β羟基丁酯膜片、二醋酸二丁基锡析聚氯乙烯膜片、高密度聚乙烯膜片制成大小与96孔板孔底的大小形状一致,制备消毒过程同上。
1.2.4方法将96孔板分成三个区域:Ⅰ区,高温浸提液区;Ⅱ区,常温浸出液区;Ⅲ区,直接接触膜片区。应用2×10个细胞/mlL929细胞悬液接种于3块96孔塑料培养板上,每组5孔,每孔100μl(Ⅲ区在接种细胞前已置入孔内3种膜片),培养24小时以使细胞贴壁,24小时后进行培养液交换,即Ⅰ区舍弃原培养液加各种50%高温浸提液+RPMI1640各100μl。Ⅱ区舍弃原培养液分别加各种常温浸出液200μl,空白对照组用新鲜的RPMI1640200μl交换。Ⅲ区各孔用新鲜培养液RPMI1640200μl交换。然后置入培养箱培养,分别于1、3、5天各取出一块培养板,每孔加入20μlMTT溶液继续培养6小时,然后吸出孔内液体每孔加入150μl二甲基亚砜,振荡10分钟后,用DG-1型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)在490nm波长检测光吸收值(OD),取5孔平均值,再通过下列计算相对增殖率(RelativegrowthrateRGR)[2]。RGR=实验组吸光值/阴性组对照组吸光值×100%最后根据RGR均值按以下评分标准对材料评定毒性程度
2结果PHB高温浸提液和常温浸出液吸光值及RGR值见表1、表2,在PHB成品上种植L929细胞后的吸光值及RGR值见表3。
从表1中看出:PHB高温浸提液随着L929细胞培养日数增加,其吸光值也增加,而阳性对照组PVC的毒性稳定,说明高温状态下PHB及成品性能稳定,无毒性浸出物。从表2看出:PHB常温浸出液PHB随着L929细胞培养日数的增加,吸光值增加,说明常温状态下PHB性能稳定。在常温下无毒性浸出物。从表3看出阴性对照组高密度聚乙烯膜片稳定无毒性。而PHB上种植L929细胞随着培养日数增加,其吸光值随之增加,说明该材料细胞相容性好,而阳性对照组毒性稳定。
3讨论
3.1关于材料的细胞毒性生物材料中一些易溶出物质是引起炎症反应和组织反应的主要原因,易溶出物质一般是原料单体、低分子聚合物、催化剂、溶剂、稳定剂、乳化剂为研究这些溶出物的细胞毒性。根据ISO7406技术报告选择生物材料应基于:①材料的物理和化学性质的稳定;②没有造成潜在毒性问题的可滤除成份。在121℃获得的PHB提取物不产生毒性表明处于高温情况下PHB性质是稳定的,即基本上没有毒性成份浸出,而在常温37℃5%CO2、95%空气基本上模拟体内环境,其浸出液的细胞毒性实验说明PHB有较好的生物相容性,对医用植入材料更具有意义。另外,一般来讲受试材料的浸渍程度越高细胞抑制程度越大[4],而本实验除高温浸提物为50%浓度外,其余则采取原液,仍表明该材料无细胞毒性。即很好的细胞相容性。由于直接接触法对材料的细胞毒性敏感性最高,可测出材料的微弱的细胞毒性[5]。直接在PHB及成品PHB上接种细胞表明该材料对细胞的生长活性无影响,合乎细胞的生长活力曲线,也说明该材料是无毒性,具有很好的细胞相容性。除此之外,也能看出PVC作为阳性对照具有稳定的细胞素性。是细胞毒性实验的理想阳性对照物[6]。
3.2关于试验方法目前体外细胞毒性试验的方法很多,各有其不同,但归结起来有:①体外培养所用细胞分成两类,其一为已建株的细胞系,其二为原代培养细胞;②细胞与材料的接触方式可以是直接接触、间接接触或通过材料浸渍液方式接触;③最终的检测指标较为多样,不同的生物学终点(Biologicalendpoint)都可以作为细胞损伤的指征。本实验所采取的细胞毒性评价方法是四唑盐比色法[7、8],由于该方法测定生物学终点是重要的细胞器--线粒体,而线粒体在细胞生命活动旺盛时增多,衰退时则减少,因此MTT无疑的能灵敏地反应出所测试材料对细胞造成的毒性损害程度,细胞毒性试验已成为常用的检测新的生物医学材料是否具有良好的生物相容性的初筛手段,而本材料通过细胞毒性实验表现出很好的细胞相容性。现在我们正根据国际标准化组织所推荐的生物试验水平,已开始该材料二期试验,PHB这一新型生物降解材料PHB的各项生物相容性试验正在进行之中。
参考文献
1郭秀君,于昕.一种型生物塑料(PHB)的研究进展和开发前景.生物工程进展.1997;Vol17.No.5
2ParkJC.etal.Astudyofsomeveriblesisatrtraziliumdye(MTT)basedassayforcellgrowthandchemosensitirity.Br.JCancer,1987;56(3):279
3张彩霞.应用细胞培养法对复合树指充填材料的毒性研究.口腔医学.1982;2:40
4Jialsun,Miaoxue,Massanoki.kikuchieffectsofsr-hydroxyapat-microcrystaloncultureceel
5梁卫东.细胞培养法评价生物材料生物相容性研究进展.生物医学工程学杂志.1999;16(1):89
6BiologicalEvaluationofDentalalmaterials.ISO/IR74061984
7ReltanasathrerS.WalahaJC.HanrsCTetal.cytotoxicintetrativeEffectsofdentinBondingcomponentsonmouseFibroblastsJDent1991,74.1602
1植物抗菌肽作用机理
大多数已知的植物抗菌肽是通过在细胞膜上形成穿孔，导致离子和代谢物泄漏，从而干扰呼吸过程，最终导致细胞死亡[2]。细胞膜分子的两性结构及其在生理pH值下带正电荷的特征可能是植物肽与膜脂质发生作用的重要原因。阳离子残基吸引如阴离子磷脂、脂多糖或磷壁酸等带负电荷的分子，从而使得肽链在细胞膜表面积聚，当浓度达到阈值时细胞膜就开始崩溃[3]。为解释这种现象科学家们提出了3个主要模型[4]：桶板模型、虫洞模型和地毯模型。
2植物抗菌肽的主要分类
2.1硫素
硫素是抗菌肽的一种，其分子质量较低（约5kDa），富含精氨酸、赖氨酸和半胱氨酸残基。其结构包括2个反向平行的α-螺旋和1个反向平行的双链β-折叠，以及3个或4个保守的二硫键。硫素几乎出现在每1个重要的植物组织中，从胚乳到叶子均有发现。硫素的抗菌活性是蛋白与细胞膜交互作用的结果，带正电的硫素与带负电荷的真菌细胞膜的磷脂通过静电作用相互结合，诱导细胞膜表面的缺陷，导致膜的不稳定性并破坏脂双层。
2.2防御素
植物防御素是小的、碱性的、富含半胱氨酸的多肽链，含有45~54个氨基酸，在等电点时带正电荷。植物防御素的生物活性包括抗真菌、抗菌、蛋白酶和昆虫淀粉酶抑制剂等特性[5]。植物防御素有相当多变的氨基酸组成，但是三维立体结构很保守，包括1个三链的β-折叠和1个与之平行的α-螺旋，由4个二硫键维持整个结构的稳定性。植物防御素可能利用葡糖神经酰胺作为插入真菌细胞膜的受体。然后，借助防御素所带的正电荷和细胞膜相互吸引，并插入细胞膜内，导致膜破坏、不稳定性和离子流出。抗菌肽最大的特点是对细菌、真菌、病毒等多种植物病原体具有抗菌活性[6]。此外，防御素对植物的生长、发育及生殖过程也有一定影响[7]。
2.3脂质转移蛋白
小型非特异性脂质转移蛋白（ns-LTPs）具有在体外不同细胞膜之间转移脂类的功能。它能够参与细胞膜的合成、细胞内的脂肪酸含量的调节，并对动植物病原体起到一定防御作用。它们的抗真菌作用方式可能是插入到真菌的细胞膜上形成穿孔，使胞内离子外流，最终导致细胞死亡。所有的LTPs都具有相同的结构特征，具有一个由4个α-螺旋包绕形成的疏水性腔，被4个二硫键紧紧连接形成紧密结构[7]。LTPs的疏水性腔可以结合磷脂、类固醇等多种脂质分子，具有体外抗菌和抗真菌的活性，因此被归类为PR-14组。有些ns-LTPs是水果、蔬菜、坚果、花粉和乳胶中重要的过敏原[8]。
2.4蜕皮素
蜕皮素是从马铃薯块茎中分离出来的具有63个氨基酸残基的抗菌肽，这些多肽的氨基酸序列具有多样性，但对于不同植物具有相同的抗菌和抗真菌病原体的能力。蜕皮素是碱性蛋白，富含半胱氨酸残基，可以形成6个二硫键，进而稳定蛋白结构。在生长发育的不同阶段，马铃薯中的蜕皮素-1（StSN1）基因是一直表达的，不受生物、非生物压力的影响作用。而蜕皮素-2（StSN2）基因的表达是受局部伤害诱导的，对病原体感染具有不同的反应[9]。StSN1的氨基酸序列和番茄GAST家族（赤霉酸刺激转录反应）的氨基酸序列具有相似性，因此归类于蜕皮素/GASA家族[10]。蜕皮素/GASA蛋白在不同的植物器官中均有表达。大部分的蜕皮素/GASA基因是受植物激素调控的，参与植物激素信号调节途径，控制激素含量水平和激素反应过程。
2.5环肽类蛋白
环肽类蛋白是在细菌、植物和动物中发现的圆形蛋白[11]。植物环肽类蛋白含有28~37个氨基酸，包含1个头-尾环化的主链以及3个位于环化半胱氨酸结点（CCK）分子内的二硫键，具有较高的序列相似性和结构相似性。CCK是形成环肽类蛋白特殊稳定性的主要原因，它迫使蛋白质的疏水部分暴露在分子表面，疏水性残基在表面上形成1个斑点，使整体结构呈两亲性，因此它们对多种蛋白酶的水解和降解过程具有抗性[12]。植物环肽类蛋白是基因编码的通过核糖体的生物合成路径产生的多肽，该环肽类蛋白前体通常包含1个内质网ER信号，1段肽链，1个N-端重复序列（NTR）和1个C-端短肽尾。NTR区域具有两亲性螺旋结构，可以指导环肽类蛋白结构域的正确折叠[13]。C-端区域（CTR）区域内保守的天冬氨酸残基表示该部分蛋白可能是一种天冬酰胺内切蛋白酶的作用对象。
2.6细胞穿透
肽细胞穿透肽（CPPs）可以协助目的蛋白通过细胞膜转入活细胞当中[14]。不论体内还是体外条件下，CPPs在微摩尔浓度时就能够穿透细胞膜，而无需任何受体的协助，也不会对细胞膜造成任何显著损伤[15]。它们可以和目标物（核酸、低聚核苷酸、肽序列和寡糖）相结合，并将其有效地转运到细胞内，因而在药物递送过程中具有潜在应用[16]。不同的CPPs和CPP-结合物可以通过不同的机制进入细胞内，并最终进入不同的亚细胞区室。这些较短的、带正电荷的小肽具有不同的氨基酸序列，但是都具有转导结构域，并有带有不同程度的呈阳离子性的Arg和Lys残基。尽管CPPs具有很大的序列多样性，但是可以分为3种主要类别：阳离子型、两性型和疏水型CPPs[17]。这些多肽和蛋白质是转录因子、细菌或病毒表面蛋白、毒素、两亲性螺旋肽的局部序列衍生物，也可以从膜结合受体或黏附蛋白的配体中得到。
3植物抗菌肽在生物技术方面的潜在应用
抗菌肽是由具有保守序列的小型基因编码的、可以通过基因扩增和基因转移的方法来增加目标多肽的产量及其特异性活力。许多研究已经证明，植物防御素的转基因表达可以使植物组织免受病原体的攻击。硫素是发展转基因植物的重要工具，通过表达更高水平的硫素，可以增加对病原体的抗性，进而减少农业中的损失，并且可以减少农业生产中更高剂量的杀虫剂的使用；环肽类蛋白在开发新型抗生素和生物杀虫剂的研究中也具有重要作用，不同的CPPs可以成功地将高分子量药物导入细胞，也可以用于疫苗研发。由于其在透皮给药系统中的巨大潜力，CPPs在药物生物技术中的应用越来越流行。
4结语
动植物细胞亚显微结构模式图
学习细胞亚显微结构时，要充分利用相关资料中的图片，建立细胞的空间立体模式图。结合教材的插图，明确动植物细胞亚显微结构及两者的区别。然后以细胞的结构模式图为核心，根据结构决定功能的特点去学习、掌握细胞的有关结构和功能。要准确识别各种细胞或细胞器，必须牢记教材中相关的细胞亚显微结构图，同时要求学生平时要注意细胞亚显微结构图的绘制，并关注以下知识：
一、动物细胞、植物细胞结构的比较
1.相同点：都有细胞膜、细胞质、细胞核；细胞质中都有线粒体、内质网、核糖体、高尔基体等细胞器。2.不同点：动物细胞无细胞壁、叶绿体，有中心体；有些低等的动物有液泡；植物细胞有细胞壁、叶绿体、液泡；中心体见于低等植物中。
二、细胞结构图像辨别
1.真核细胞、原核细胞图像的判断图像中：有核膜（或有核膜围成的真正的细胞核），则为真核细胞；无核膜则为原核细胞。2.动植物细胞图像的判断图像中：有中心体，无细胞壁、叶绿体、液泡，则为动物细胞；有中心体，有细胞壁、叶绿体、液泡，则为低等的植物细胞图；无中心体，有细胞壁、叶绿体、液泡，则为高等植物细胞图。
三、相关细胞结构知识点归纳总结
1.产生水的结构：线粒体（有氧呼吸）、核糖体（脱水缩合）、叶绿体（光合作用）。2.产生ATP的结构：叶绿体（光合作用：光能―电能―ATP―稳定的化学能）、线粒体（有氧呼吸：稳定的化学能――ATP）、细胞质基质（无氧呼吸、有氧呼吸的第一阶段）。3.与主动运输有关的细胞器：线粒体（供能）、核糖体（合成载体蛋白）。4.生理活动中遵循碱基互补配对原则的结构：细胞核（DNA复制、转录）、线粒体（自身DNA复制、转录、翻译）、叶绿体（自身DNA复制、转录、翻译）、核糖体（翻译）。5.参与细胞分裂的细胞器：中心体（间期发出星射线形成纺锤体）、高尔基体（末期与植物细胞壁形成有关）、线粒体（供能）。6.含色素的细胞器：叶绿体（含叶绿素与类胡萝卜素）、液泡（含花青素等）。7．分泌蛋白的合成、加工及运输有关的细胞器：核糖体（将氨基酸脱水缩合形成肽链）、内质网（将肽链折叠、组装和加糖基团）、高尔基体（对蛋白质进行再加工）、线粒体（供能）。
四、特别提醒
1.在同一个细胞内，CO2从产生到利用要经过4层膜，8层磷脂分子；在相邻细胞间，CO2从产生到利用要经过6层膜，12层磷脂分子。2.真核生物：无叶绿体不能进行光合作用；无线粒体不能进行有氧呼吸。3.原核生物：无叶绿体但含光合色素可进行光合作用（如蓝藻）；无线粒体可进行有氧呼吸（如硝化细菌）。
典例：下图是动植物细胞亚显微结构模式图。请据图分析：
（1）如果B图是蓝藻细胞的结构模式图，除了没有外，在细胞质中应只有种细胞器。
（2）如果B图是根尖生长点细胞，细胞的形状应为，同时还应没有图中的、等结构。此类细胞分裂时，代谢特别旺盛的是、、等细胞器。若B图是洋葱表皮细胞，A图是口腔上皮细胞，将其同时置于0.3g/mL的蔗糖溶液中，将分别发生和现象。
（3）在生物工程中，植物体细胞杂交过程中应首先用酶去掉，得到体。
（4）若A图为人体的效应B细胞，则该细胞应由细胞分化而来，其产生的抗体的化学本质是，它能与发生特异性结合，发挥免疫效应，该过程属于―免疫阶段。抗体从合成到分泌出细胞依次经过的细胞结构是（写标号）。
（5）若A图是人的大腿肌肉细胞，在人体进行长跑时，大腿肌肉感到酸痛，这是由于在活动中产生所引起的。该物质进入血液后会和血浆中的pH缓冲物质发生反应。
（6）若B细胞线粒体中产生的一分子CO2扩散进入一个相邻细胞进行光合作用，则该CO2分子穿过的细胞膜的方式称为。
（7）若B是紫色洋葱鳞片叶细胞的一部分，则色素主要存在于。
答案：（1）细胞核1（2）正方形液泡叶绿体③⑥⑦质壁分离细胞萎缩（3）纤维素酶和果胶细胞壁原生质（4）B淋巴细胞或记忆蛋白质抗原效应③⑦⑤（5）乳酸NaHCO3（6）自由扩散（7）⑨液泡
1.1原植物鉴定
1.1.1决明
CassiaobtusifoliaL.一年生半灌木状草本，高1～2m。偶数羽状复叶互生，有小叶2～4对，在下面两小叶之间的叶轴上有针刺状暗红色腺体；小叶倒卵形，长1.5～6.5cm，宽0.8～3cm，先端圆形有小突尖。花成对腋生；小花梗长1～2.3cm；萼片5，分离；花瓣5，黄色，倒卵形，长约12mm，具短爪；发育雄蕊7。荚果条形，长15～24cm。种子多数，菱状方形，淡褐色或绿棕色，有光泽，两侧面各有一条线形的浅色斜凹纹。花期7～9月，果期9～11月。全国大部分地区有栽培。生于村边、路旁、山坡等地。
1.1.2小决明
CassiatoraL.与决明形态相似，不同点为：植株较小，臭味较浓。下面两对小叶间各有一个腺体；小花梗，果实均较短；种子较小，两侧各有一条宽广的浅黄绿色带。分布于中国台湾、广西、云南等热带、亚热带地区，野生或半野生。生于村边、路旁、荒地等土壤肥沃处。
1.2药材性状鉴别
1.2.1决明
略呈菱方形或短圆柱形，两端平行倾斜，形似马蹄，长3～7mm，宽2～4mm。表面绿棕色或暗棕色，平滑有光泽，一端平坦，另端斜尖，背腹面各有一条突起的棱线，棱线两侧各有一条斜向对称而色较浅的线形凹纹。质坚硬，不易破碎。种皮薄，胚乳灰白色半透明，子叶2，黄色，呈“S”形折曲并重叠，中间有多处弯曲。气微，味微苦。
1.2.2小决明
呈短圆柱形，较小，长3～5mm，宽2～3mm，表皮棱线两侧各有一片宽广的浅黄绿色带。子叶呈“S”形折曲并重叠，中间无弯曲。
1.3显微鉴别
1.3.1组织鉴别
决明：最外为厚的角质层，表皮为一列栅状细胞，壁不均匀加厚，在细胞1/2和下1/3处各有一条光辉带；其下为一列支持细胞，略扁状厚，相邻两细胞间有大的细胞间隙；内方为6～8列营养层薄壁细胞，越向内越狭长，内含酸钙簇晶，直径7～14μm；最内一列种皮细胞排列整齐，长方形；胚乳细胞壁不均匀加厚，含糊粉粒。子叶为单面叶，上下表皮均为一列排列较整齐的细胞，且上表皮细胞较下表皮细胞大；栅栏组织为两层圆柱状细胞，靠近上表皮的一层细胞较下层细胞长；海绵组织细胞椭圆形，靠近栅栏组织部分细胞呈类圆形，排列较为整齐，可见细胞骤小聚集成簇现象。见图1～2。
小决明：草酸钙簇晶较多，直径为15～23μm，部分支持细胞呈葫芦形，营养层细胞5～6列。见图2～4。
1.3.2粉末鉴别决明：粉末黄棕色。①角质层碎片透明，表面可见波状弯曲的网状花纹。②栅状细胞侧壁不均匀加厚，表面观细胞多角型，壁厚。③支持细胞侧面观呈哑铃状表面观多角形，并可见上下两层同心圆。④草酸钙簇晶散在，或存在于子叶、种皮薄壁细胞中，直径7～14μm。⑤胚乳细胞壁不均匀加厚，含糊粉粒。见图5。
小决明：粉末绿棕色。①角质层碎片较少，表面观可见多角形网状花纹。②部分支持细胞表面观不见两层同心圆，内为一不规则类圆形胞腔。③草酸钙簇晶较多且大，直径15～23μm。见图6。
2材料
分别收集了四川、陕西、重庆等产地的决明CassiaobtusifoliaL.原植物和种子，以及广西、成都中医药大学苗圃的小决明CassiatoraL.原植物和种子。药用植物和药材均由成都中医药大学卢先明教授鉴定。
3讨论
决明和小决明药材在性状和显微结构上大体相似，但仍存在一定差异。见表1。表1决明和小决明药材性状和显微特征对比（略）
在收集的商品药材中，决明和小决明的种子常常混杂在一起，其中小决明的种子仅占很小的比例，二者性状相似，因而易混淆，鉴别二者最重要的依据是种子棱线两侧为条形凹纹还是宽带。
本文首次发现了决明子子叶细胞中的海面组织有细胞骤小聚集成簇的现象，且在决明的种子中排列较为规则、多见，而在小决明中则较少见，是否可以将此作为二者区分的依据，有待进一步研究。
决明和小决明在显微结构上大体相似，都有角质层、栅状细胞层、支持细胞层、营养层、胚乳及子叶。子叶为单面叶，叶中有两层栅栏细胞等，但在其形状大小、数量上仍存在着差异，可以利用这些显微特征来鉴别，其中最为显著的是草酸钙簇晶和支持细胞。
【参考文献】
［1］国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,2005:98.
摘要细胞骨架在调控向重力性反应早期的信号感受和传导过程中起重要作用。阐述了植物根系材料的力学特性,介绍了植物感受重力的2种假说,分析了细胞骨架蛋白在重力信号传导链中的作用及细胞骨架与高等植物向重性的关系,以期为细胞骨架和植物向重性的研究提供依据。
关键词微重力;植物;细胞骨架;影响
向重力性反应是植物适应地球重力场环境的一个重要生理过程,是植物能够正常生长发育不可缺少的反应机制。高等植物根的向重力性使其能够充分吸收土壤中的水分和矿质营养,茎的负向重性使其能够充分接受光照。研究表明,植物感受重力与信号传递之间的精确调控可能是通过不同细胞器之间的相互作用来实现的。细胞骨架被认为是与植物向重性有关的重要细胞器之一。细胞骨架(cytoskeleton)是指真核细胞中的蛋白质纤维网架体系[1]。细胞骨架不仅在维持细胞形态、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用,而且还与细胞运动、物质输运、能量转化、信息传递、细胞分裂和分化、细胞凋亡、细胞的癌变、基因表达等生命活动密切相关。
1植物根系材料的力学特性
植物根系材料不同于一般的工程材料,研究其力学特性,最大的困难在于它参与代谢活动,具有多相、非均匀、各向异性等特点,其应力不仅与应变有关,还与流动因素有关。在不同生理和生长环境下,其力学性质存在很大差异[2]。许多国内外专家学者对木本植物、草本植物、农作物的根系进行了大量的拉伸、压缩、弯曲、冲击、应力松弛、糯变试验等研究,得到了少数根系的拉伸最大载荷、应力、应变、弹性模量、弯曲应力等参数,得到了个别根系的冲击韧性、应力松弛、糯变试验数据和曲线,推得了本构方程、应力松弛方程和糯变方程等。尽管这些研究成果是初步的、不全面的,但它们已在防风治沙、防水土流失等生态环境建设工程中发挥了重要作用,为植物根系力学的进一步发展奠定了基础。
2植物感受重力的2种假说
植物重力信号感受机制一直是生物学界争论不休的话题。截至目前对于重力信号感受的解释主要有2种,即淀粉平衡石假说与原生质体压力假说。
淀粉平衡石假说认为,重力信号是由一类结构特殊的细胞即平衡细胞来感受的。在根中平衡细胞是位于根冠的柱状细胞,而在下胚轴和花序轴中平衡细胞是内皮层细胞。这2种细胞都是高度极化的细胞,但存在结构上的特异性。平衡细胞的细胞核位于细胞的中部或顶部,细胞质可以分为2层,包含内质网的周边区域和富含肌动蛋白微丝的中央区域。平衡细胞最显著的结构特征是都含有淀粉体[3]。淀粉体起平衡石的作用,其比重大于细胞质。在垂直生长的器官中,这些淀粉体沉降在细胞的底部,当植物器官在重力场中的方向发生改变,这些淀粉体因为比重较大,重新沉降到新的物理学底部。中柱细胞和内皮层细胞就是通过这些淀粉体的沉降来感受重力的变化。
原生质体压力假说是平衡石假说之外的另一种关于重力感受的假说。在拟南芥无淀粉体的突变体中,尽管重力敏感性降低,但给予植物长时间的重力刺激,其根仍能发生一定程度的向重力方向弯曲。因此,有人认为在植物体中除了结构特异的平衡细胞外,植物的原生质体本身也可以感受到重力的改变。原生质体压力假说的主要内容是:当植物体的原生质体在重力场中的取向发生改变时,原生质体上部的细胞膜与细胞壁之间的张力增强;这种张力的改变通过特异的区域,即细胞膜与细胞壁通过细胞骨架相连接的区域,传递到细胞膜上改变细胞膜的张力,从而活化质膜上张力敏感的离子通道,特别是钙离子通道;胞质中钙离子浓度的改变引发下游的信号传导,最终引起植物器官的向重性弯曲。
3细胞骨架结合蛋白在重力信号传导链中的作用
3.1微丝结合蛋白
细胞骨架结合蛋白可分为微丝结合蛋白(abps)和微管结合蛋白(maps)。在植物中研究得最清楚的abps是微丝单体结合蛋白以及抑制蛋白和微丝解聚因子,如adf/丝切蛋白。这2类蛋白都是由多个基因家族编码,在微丝骨架组成方面起着重要的作用。过量表达adf的拟南芥植株生长缓慢,细胞纵向的微丝束消失;而抑制adf表达则可刺激细胞伸展和细胞伸长生长,同时细胞形成粗的纵向微丝束。细胞周边部位的微丝网络可能是这一蛋白的作用靶点,但是由于周边微丝的动态性与不稳定性,通常很难通过图像观察到其变化[4]。重力刺激可能调控某些细胞骨架结合蛋白的活性,进而引起细胞骨架重组。如在受到重力刺激的早期拟南芥根的柱状细胞和玉米的胚芽鞘细胞质的ph值发生改变,adf的活性受到磷酸化与去磷酸化的调控。在高的ph值条件下adf调控微丝的解聚,并可能因此改变平衡细胞中微丝骨架的动态性。
3.2微管结合蛋白
与微丝相似,微管重组的过程中微管聚合和解聚的调节可能与结合蛋白有关。利用拟南芥突变体分析微管结合19蛋白的功能取得了巨大的进展。最近发现的细胞壁束间纤维束机械强缺失突变体(fra2)和下胚轴减少伸长突变体(botero1)都表现为周边微管的扰乱。
4细胞骨架与高等植物向重性的关系
细胞骨架不仅在维持细胞形态、承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用,而且还参与许多重要的生命活动。如在细胞分裂中细胞骨架牵引染色体分离;在细胞物质运输中,各类小泡和细胞器可沿着细胞骨架定向转运;在植物细胞中细胞骨架指导细胞壁的合成。
研究认为,细胞骨架一方面在细胞质中形成网络,受到沉淀的淀粉体的牵动,另一方面与质膜上的受体相互作用,激活受体,启动重力信号传导过程。最近的研究表明,细胞骨架不仅是细胞感受重力信号的重要环节,而且对根尖细胞中的生长素运输起重要的调控作用。对生长素运输载体(pin)突变体根向重力性反应的研究表明,生长素的极性运输与其向重力性反应有关。微丝解聚剂(如cytochalasin)可减少生长素的极性运输,也影响根的向重力性[5]。
5结语
细胞骨架和植物细胞向重性研究表明,植物向重性现象是一个集研究细胞骨架排列、信号传导、植物激素行为、植物生长调控于一体的完美系统。传统的研究细胞骨架和植物向重性的方法已加入了新的生物学技术,如免疫荧光技术、套笼探针技术和其他新发展的显微技术。免疫荧光技术可以观察到向重力性过程中细胞骨架的重排,套笼探针的微注射技术可以观察到细胞骨架的实时动态变化过程[6]。利用修饰细胞骨架的荧光报告蛋白可以观察到活细胞中细胞骨架的变化,采用荧光蛋白显示剂监测细胞质中钙和ph值变化已用于保卫细胞中信号传导的研究,以及根的发育和向重力性的研究。
6参考文献
[1]刘贻尧,王伯初.植物对环境应力刺激的生物学效应[j].生物技术通讯,2000(11):219-222.
[2]段传入,王伯初,王凭青.水稻茎的结果及其性能的相关性[j].重庆大学学报,26(11):11-13.
[3]程洪,张新全.草本植物根系网固土原理的力学试验探究[j].水土保持通报,2002,22(5):20-23.
[4]陶祖莱,孟庆国.关于我国生物力学发展的几点意见[j].力学进展,2000,30(3):472-475.
Isolation,labellingandautotransplantationofleftauriclemyocytesinadultrabbit
【Abstract】AIM:Todevelopareliablemethodforisolationandfluorescentlabelingofadultrabbitleftauriclemyocytesandtoinvestigatethesurvivalofgraftedautologousleftauriclemyocytes.METHODS:TwentyadultNewZealandrabbitswererandomlyassignedtotransplantgroupandcontrolgroup(n=10).TheleftauricleofrabbitwasligatedandharvestedandtheauricularcellswereisolatedandlabeledwithDAPIexvivo.Eitheracellsuspension(transplantgroup)orculturemedium(controlgroup)wasinjectedintothenormalleftventricularanteriorwall.Therabbitsweresacrificedafter4weeksandspecimenswereharvestedandobservedbyhistologicmethods.RESULTS:Mostoftheisolatedcellswereobservedrodshaped.Themorphologicfeatureofthesecellscorrespondedtothatofauriclecardiomyocytesandthecellactivitywasgood.The“cellisland”couldbefoundinmyocardialinfarction(MI)areaoftransplantgroup,andthenucleiwithbluefluorescencecouldbefoundintransplantgroup,butnotincontrolgroup,whichconfirmedthesurvivalofimplantedcellsandthereliabilityofDAPIlabeling.Vasculardensityintransplantgroupwasbetterthanthatincontrolgroup(P=0.02).CONCLUSION:EnzymedigestionandDAPIlabelingarereliablemethodsfortheisolationandlabelingofleftauriclemyocytesinadultrabbits.IsolatedandDAPIlabeledauriclemyocytescansurviveafterautograftedintonormalventricularanteriorwallandmayimproveperipheralvascularproliferation.
【Keywords】myocardium/cytology;isolation;label;transplantation,autologous
【摘要】目的：建立可靠的成年兔心耳心肌细胞的急性分离和荧光标记的方法，观察心耳肌细胞移植到自体左室前壁的存活状况.方法：成年新西兰白兔20只，随机分为移植组和对照组（n=10）.结扎并剪取自体左心耳组织，急性消化分离为单细胞，经DAPI标记后分别将细胞悬液和培养基注射到移植组和对照组自体正常左室前壁内.4wk后处死兔子，取移植区组织进行组织学观察.结果：急性分离的细胞中绝大部分为杆状，形态结构符合心耳肌细胞的特征，且细胞活性好.移植组梗死区内可以观察到“细胞岛”状结构，行荧光检测可见蓝色荧光的细胞核，而对照组梗死区内无细胞结构，证明移植的心耳肌细胞在移植区存活以及DAPI标记的可靠性.与对照组相比,移植区血管密度增高（P=0.027）.结论：酶消化法和DAPI荧光标记是一套可靠的心耳肌细胞急性分离和标记方法；急性分离的心耳肌细胞移植到自体左室前壁后可以存活，并能够促进周围血管生长.
【关键词】心肌/细胞学；分离；标记；移植，自体
0引言
目前正在研究的心肌细胞移植技术是通过向已梗死的心肌组织内移入新的细胞，以改善心脏功能［1］.本文旨在建立一套可靠的成年兔心耳肌细胞的分离标记方法，并对其移植到自体心肌组织进行研究,为进一步应用心耳肌细胞移植治疗缺血性心脏病提供实验基础.
1材料和方法
1.1材料
成年健康新西兰白兔20只,雌雄不限,体质量2.0~2.5kg,购自第四军医大学实验动物中心.将实验动物随机分为移植组和对照组（n=10）.小牛血清(Gibco),DMEM高糖培养基(Gibco公司),胰蛋白酶(Gibco公司),胶原酶Ⅱ型（Sigma公司）,4,6二脒基2苯茚二酮(Sigma公司).
1.2方法
1.2.1自体左心耳心肌组织的取材取成年兔经耳缘静脉注射戊巴比妥钠（30mg/kg），左侧胸骨旁切口，切断第4肋骨进胸，向上推开胸腺，剪开心包，显露并牵引左心耳，用4号丝线结扎左心耳基底部后，剪取左心耳并立即置于预冷（4℃）的普通台式液中.用盐水纱布覆盖伤口.
1.2.2左心耳心肌细胞的消化分离参照文献［2］，在无钙台式液(mol/L:NaCl140,KCl5.4,MgCl21,酶糖10,HEPES5,pH7.4)中洗去血凝块，用眼科剪将心耳组织剪碎，移入含有1.25g/L胰酶、0.25g/L胶原酶的无钙台式液中，37℃消化10min.轻柔吹打，自然沉淀后弃上清.再加入酶消化10min，轻柔吹打后，吸取上清，移入等体积含100mL/L新生牛血清的DMEM培养液中.重复消化剩余组织2～3次，直至基本不可见有形组织.将收集的细胞悬液1000r/min,离心5min,弃上清，调整细胞密度为2×109/L.
1.2.3分离细胞的活性鉴定参考文献［3］将40g/L的台盼蓝溶液与细胞悬液按照1：9混匀，进行染色,3min后用红细胞计数板分别计数活细胞和死细胞,计算活细胞率［3］.
1.2.4分离细胞的标记参照文献［4］加入0.2g/L的4,6脒基2茚二酮(DAPI)于孵箱内（37℃）荧光标记细胞2h,使用锡箔包裹.用普通台式液(mol/L:NaCl140,KCl5.4,CaCl21.8,MgCl21,glucose10,HEPES5,pH7.4)漂洗以去除未结合的DAPI.离心后收集细胞，加入无血清DMEM培养液制成细胞密度为2×109/L的细胞悬液,以备细胞移植.
1.2.5分离细胞的观察心肌细胞移植术前,动态观察分离的心肌细胞,荧光显微镜观察用DAPI标记好的心肌细胞.
1.2.6心肌细胞移植在左室前壁缝50涤纶线以作标记，移植组将心肌细胞悬液经特制的微量注射器注入左室前壁缝线标记上方0.5cm处，对照组以相同量的DMEM培养液注射.逐层关胸,伤口局部应用抗生素,手术中未发生气胸及恶性心律失常.
1.2.7结果观察4wk后用过量麻醉剂处死动物,取左室前壁缝线标记点上方心肌组织，40g/L甲醛固定48h,行常规HE染色，使用荧光显微镜观察并拍照.观察移植区内组织结构及血管密度.同时,对移植部位石蜡切片(移植组及对照组动物取样2个/只,共取样本40个)，用第Ⅷ因子免疫组织化学染色移植区内血管,光学显微镜200倍视野下血管计数,统计移植区血管密度.
统计学处理：结果以x±s表示，采用SPSS11.5软件进行数据处理,组间比较用t检验.
2结果
2.1分离细胞的形态学观察及细胞活性对用酶消化法分离获得的成年兔左心耳心肌细胞进行形态学观察,倒置显微镜下可见细胞大部分呈杆状，边缘清楚，胞质丰富(Fig1),DAPI标记2h后可见细胞核大,多为单核或多核.经台盼蓝染色,死细胞染成淡蓝色,活细胞拒染，计算活细胞率为95%.
2.2移植细胞在移植部位的存活情况细胞移植后4wk，对移植部位心肌组织切片进行HE染色后观察，光镜下可见移植部位心肌组织内心肌纤维排列整齐，方向基本一致，在移植细胞周围没有观察到淋巴细胞浸润.在相差荧光显微镜下可以观察到移植组标本中带有蓝色荧光的细胞核，证实移植的心耳肌细胞在移植部位存活.
2.3血管增生对移植部位石蜡切片，用第Ⅷ因子行免疫组织化学染色,光学显微镜200倍视野下观察血管计数,移植区血管密度(6.7±2.1)，高于对照组(3.6±1.2,P=0.027)，提示将自体心耳肌细胞移植到左室前壁后可以促进周围血管增生.
3讨论
本实验中,我们选用左心耳作为细胞来源，取材简便，取材后对心功能影响不明显.考虑到成年心肌细胞不能继续分裂，故未进行体外培养，而是选择分离标记后进行细胞移植.在酶消化的过程中，除了按预定的时间进行消化外，还应根据肉眼观察心耳肌组织碎块的絮状变化的程度，来决定中止酶消化的时机.无钙环境和酶消化时间过长将会损害细胞膜，并导致“钙反常”，使细胞功能受损.
我们将分离的兔自体心耳肌细胞移植到正常左室前壁后,4wk后荧光检测可以发现心肌标本中带蓝色荧光的细胞核,说明移植的心肌细胞在梗死区内存活，同时可以观察到有血管形成，提示移植的心耳肌细胞可能分泌一些细胞因子如血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)［5,6］等，促进移植区内血管的增生，以适应性加强局部血液供应.我们在移植细胞周围没有观察到大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润，说明自体心肌细胞移植不会产生免疫排斥相关的炎性反应.通过本实验对自体心肌细胞移植的可行性研究，为下一步研究自体心肌细胞移植到梗死区心肌以治疗缺血性心肌病提供了实验基础.
【参考文献】
［1］LiRK,YauTM,SakaiT,etal.Celltherapytorepairbrokenhearts［J］.CanJCardiol,1998;14:735-744.
［2］LiRK,MickleDAG,WeiselRD,etal.Humanpediatricandadultventricularmyocytesinculture:Assessmentofphenotypicchangeswithpassaging［J］.CardiovascRes,1996;32:362-373.
［3］司徒镇强，吴军正.细胞培养［M］.西安：世界图书出版公司1996:181.
［4］DorfmanJ,DuongM,ZibaitisA,etal.Myocardialtissueengineeringwithautologousmyoblastimplantation［J］.JThoracCardiovascSurg,1998;116:744-751.