【关键词】Caco-2细胞营养物质吸收
Caco-2CellModelandDevelopmentofitsApplicationtoAbsorptionofFoodNutrients
Abstract：ThisarticleoverviewedthecharacteristicsofCaco-2cell，establishmentandvalidationofCaco-2cellmodel.Theresearchdevelopmentofthemechanismsofabsorptionandtransportofnutrientsextensivelywasalsoreviewed.Thismodelhasmanyadvantages，aswellasfewdisadvantages.
Keywords：Caco-2cell;Nutrients;Absorption
对于营养物质在人体内的吸收转运及其生物利用度，不同的动物之间、动物与人之间都存在或大或小的质的差异。这种种属间的差异使得动物实验数据不能完全地外推至人体，并且直接利用人体组织进行研究是非常有限的。人类细胞培养系统作为肠屏障的体外模型的应用是模拟营养物质透过小肠黏膜的机制与影响因素的一个有效的方法。它可采用人体或与人体最接近的生物材料，从而消除了动物模型和人体的巨大差异；有利于探讨营养物质动力学-结构的定量构效关系的特点；有高通量、节省时间、节省资金、有利于对组合代谢产物进行分析的特点。近十几年来，国外已普遍采用组织细胞模型作为营养物质吸收研究的工具，包括有Caco-2细胞(thehumancolonadenocarcinomacelllines)单层模型、MDCK细胞模型、MDR1-MDCK细胞模型及ECV304细胞模型。其中尤其是Caco-2细胞模型以其与体内营养物质，特别是那些被动吸收的营养物质研究的良好相关性，被普遍用于营养物质开发的早期快速筛选过程中［1，2］。
1Caco-2细胞模型概述
1.1Caco-2细胞系及其特征
Caco-2细胞系于20世纪70年代首次分离自人类结、直肠癌细胞，Caco-2细胞模型最初是由Borchardt和WorkeM在1989年提出的［3］。以普通的培养条件培养成熟的Caco-2细胞即可形成与小肠上皮细胞相同的细胞极性和致密的单细胞层组织，如图1所示，其形态和功能上与人体的小肠上皮细胞相似。在肠腔侧分化出绒毛面AP侧(apical，肠腔侧，又称黏膜剂)和基底面BL侧(basolateral，肠内壁侧，又称浆膜剂)。
AP面含有典型的小肠微绒毛水解酶和各种营养物质的转运载体，可发挥主动转运物质的作用，如糖类、氨基酸、二肽、胆酸及维生素B内源性因子的主动转运载体在Caco-2细胞都有表达；存在于小肠细胞刷状缘的酶，如氨肽酶、碱性磷酸酶、蔗糖酶及γ-谷氨酰转肽酶也同样存在于Caco-2细胞；I相代谢酶CYP1A1及Ⅱ相代谢酶谷胱甘肽S-转移酶，β-葡糖醛酸糖苷酶及磺基转移酶在该细胞系统的表达也都有报道［4］。
由于形态学及生化性质都与小肠上皮很相似，Caco-2细胞模型已被广泛地应用于体外营养物质分子肠吸收的研究。
1.2Caco-2细胞模型的建立
1.2.1Caco-2细胞的培养［5，6］将Caco-2细胞置于常规培养瓶内，以DMEM(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium)为培养液：含4.5g·L-1D-葡萄糖、L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠和碳酸氢钠，1%非必需氨基酸、1%青霉素-链霉素、10%胎牛血清，pH值为7.2。在37℃、5%CO2气流下进行培养，隔1天更换1次培养液，每5天按1:3比例传代。
当细胞长至覆盖瓶底的80%～90%时，用含0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液消化。按2×105个/ml接种于Transwell上(为一种具有0.3μm孔径的聚碳酸酯膜0.5ml/孔，起支持Caco-2单层细胞的作用)。在Transwell的下腔加入培养液1.5ml，如图2所示。接种后每两天换液1次，1周后每天换液。一般将第25～35代（培养21d，满足跨膜电阻TEER300～500·cm2。）的Caco-2细胞用于吸收和代谢研究［7］。
1.2.2Caco-2细胞模型的验证［8］为了确定Caco-2细胞单层是否建立，通常采用以下几个指标测定其完整性：①细胞形态学(小肠微绒毛结构及细胞间紧密连接)，用电子显微镜或光学倒置显微镜进行形态学上的检查；②可在单细胞层培养的不同阶段，测定小肠刷状缘细胞标志酶—碱性磷酸酶的活性；③Caco-2细胞单层的跨膜电阻(transepithelialelectricalresistance，TEER)，一般为300～500·cm2；④采用甘露醇、荧光黄、PEG4000等荧光或放射性漏出标记物测量单细胞层的跨膜通量；⑤用辣根过氧化物酶测定Caco-2细胞的胞饮功能［9］。
1.2.3Caco-2细胞用于实验的操作步骤取Caco-2细胞合格的细胞培养插件，用Hanks缓冲液冲洗掉表面的代谢物，最后1次洗涤后孵育30min测定单细胞层的跨上皮电阻等指标来控制细胞质量。根据研究目的，在细胞层的AP(或BL)侧（供池）的培养液中加入适量浓度用Hanks液溶解的待测营养物质，BL(或AP)侧（受池）中加空白Hanks液，放入培养箱中进行细胞培养实验，定时从BL(或AP)侧（受池）培养液中取样，用一定灵敏的分析手段检测营养物质含量或破碎细胞测定细胞中营养物质含量［10］。
2Caco-2细胞模型在营养物质吸收及机制研究中的应用
2.1营养物质吸收实验参数Artursson和Karlsson等［11］对不同转运途径的20多个化合物进行了研究，得出了在人体口服后经细胞和细胞旁路被动扩散的药物透过Caco-2细胞单层的转运速率［表示为表观渗透系数(apparentpermeabilitycoefficients，Papp)］，Papp可由下式计算：Papp=Qt·A·C0
其中Q/t为受池侧待测物质出现的速率，也就是渗透速率(μg·min-1)，为细胞单层表面积(cm2)，为给池侧的初始物质浓度。
2.2Caco-2细胞模型在营养物质吸收研究中的应用
2.2.1研究营养物质结构与吸收转运的关系了解化学结构对营养物质小肠吸收的影响，可大大促进有效营养物质吸收的研究。因此通过Caco-2细胞模型测得的Papp值与营养物质化学结构之间建立的联系，可以更快地合成转运性质较好的营养物质。
KaekoMurota等［12］利用Caco-2细胞研究大豆异黄酮苷元比其相应的糖苷更有效地被Caco-2细胞吸收，可能是由于其对细胞膜亲脂性强于其糖苷。并且不同于黄酮类苷元，异黄酮类苷元可以完整的形态被转运到基底外侧（B侧），可能与B环在联苯丙烷结构的位置有关。
2.2.2预测营养物质的体内吸收被动扩散营养物质的生物利用度与表观渗透系数间有良好的相关关系，可用于预测被动扩散的营养物质的生物利用度。如表1所示。表1表观渗透系数与生物利用度之间的关系（略）
2.2.3评价营养物质前体的吸收对于一些脂溶性差而造成生物利用度低的营养物质，可将其进行结构修饰，制成营养物质前体而增强营养物质分子的细胞通透性。在体内多种组织包括小肠上皮，营养物质前体被酶水解为活性成分而发挥作用。
ChureepornChitchumroonchokchai等［13］利用Caco-2细胞研究玉米黄质及其酯类前体的吸收表明，其酯类前体在小肠消化吸收过程中被其中羧基酯酶水解，并促进了玉米黄质的吸收。
通常营养物质的酯类前体可以增强营养物质分子的吸收，且在体内多种组织包括小肠上皮，营养物质的酯类前体可被酯酶水解为活性成分。
2.2.4研究营养物质相互作用对吸收的影响对于脂溶性差或分子量大的营养物质如多肽类营养物质，其黏膜透过性较差，因而体内吸收较差，可利用营养物质之间的相互作用以提高营养物质通过肠黏膜吸收的能力，从而提高其生物利用度。
人体从食物中摄取营养物质，对铁的吸收较差，铁缺乏性疾病非常普遍，如缺铁性贫血等。因而利用各种方法、因素促进铁吸收的研究相对较多。RaymondP.Glahn等［14］研究表明，半胱氨酸、还原性半胱氨酸-甘氨酸可促进铁的吸收，谷胱甘肽可经消化成半胱氨酸，还原性半胱氨酸-甘氨酸也有相同作用。
还有研究［15］表明二果糖酐III（DFAIII）、二果糖酐IV（DFAIV）、低聚果糖、棉子糖通过控制细胞的紧密连接增加胞旁转运，从而提高了Caco-2细胞中钙的净吸收。
2.2.5研究胃肠道消化作用对营养物质吸收的影响肠腔pH和胃肠道的酶类直接影响营养物质吸收，采用体外模拟消化与Caco-2细胞模型相结合，进行营养物质转运的研究，模拟营养物质吸收的生理环境，可以更准确地预测其在体内的生物利用度。
JeanelleBoyer等［16］利用胃蛋白酶、（猪）胰酶/胆汁、乳糖酶与Caco-2单层培养模型相结合研究了槲皮素及其葡糖苷的吸收情况，认为这一模型是非常可靠的研究食品中黄酮类物质生物利用度的体外模型。
ShumeiYun，RaymondP.等［17，18］也都利用体外模拟消化与Caco-2细胞相结合研究提高了铁的生物利用度，与动物实验结果具有很好的相关性，证实了这一模型的可行性。
转贴于
2.3Caco-2细胞模型在营养物质吸收机制研究中的应用通常，营养物质跨过肠上皮细胞有3种主要途径：①跨细胞转移；②胞旁转运；③载体介导转运。
2.3.1Caco-2细胞模型用于被动转运的研究90%以上的物质主要通过被动扩散进入体内［19］。这些营养物质的脂溶性好，油水分布系数大，易分布于上皮细胞脂质膜。吸收缓慢且较差的营养物质，如亲水性营养物质以及多肽等，主要经胞旁转运。而细胞旁间隙仅占肠管表面积的0.1～0.01，且紧密连接是转运的限速因素，因此胞旁转运对营养物质吸收的贡献是有限的。
2.3.2Caco-2细胞模型用于载体介导主动转运的研究除了被动转运，载体介导的主动转运在营养物质的吸收过程中也起重要作用。Caco-2细胞有3种主动转运载体［20，21］：①二肽载体；②P-糖蛋白；③寡肽载体。这些载体主要转运营养物质(氨基酸、葡萄糖、胆酸等)及与营养物质结构类似的化合物。因此，Caco-2细胞模型也可用于载体介导主动转运营养物质吸收机制的研究。
2.4Caco-2细胞模型在营养物质代谢方面的应用营养物质经肠吸收进入血液循环系统前，在肠腔、刷状缘或（和）肠壁细胞内均可能被代谢。
Caco-2细胞含有许多小肠上皮细胞中包含的酶，因此可以用来评价营养物质的代谢稳定性。
YanLiu等［22］研究表明，5，7，4'-三羟基异黄酮及其同系物的生物利用度低，不是因为其吸收差，而是因为小肠内广泛存在的Ⅱ相代谢酶的代谢作用。
3Caco-2细胞模型应用于营养物质吸收转运中的优点与局限性
Caco-2细胞模型作为营养物质吸收研究的一种快速筛选工具，能够在细胞及分子水平提供关于营养物质分子通过小肠黏膜的吸收、代谢、转运的信息；细胞分化的极性有助于研究营养物质双向（肠腔侧肠壁侧或肠壁侧肠腔侧）的转运率，从而对主动转运的营养物质进行研究；各种转运系统及代谢酶在Caco-2细胞的表达，使该模型的研究结果与体内营养物质的处置有较好的相关性；Caco-2细胞来源于人体，不会造成各种药动学性质的种属差异，其结果有较好的重现性；Caco-2细胞模型的实验条件，如转运介质的pH值及营养物质浓度比较容易控制。与动物实验相比，培养细胞要比培养动物更省时更经济。若用于营养物质的研究，细胞模型的费用要少得多。
Caco-2细胞模型的局限性在于：分化的Caco-2细胞单层中的紧密连接比在小肠上皮细胞中更具特征性，其TEER值比正常小肠上皮细胞高；Caco-2细胞由于缺乏分泌黏液的杯状细胞，因而缺乏小肠上皮中的黏液层；Caco-2细胞中某些特别的酶（细胞色素P450的一些同工酶）的活性与人体小肠上皮细胞的差别及P-gP在Caco-2细胞中表达的波动性对结果有不同程度的影响；Caco-2细胞的吸收转运体表达较小肠上皮的低，因而在主动转运营养物质的研究方面相对不如被动扩散营养物质研究的成功［23］。
【参考文献】
［1］AnnetteB，SibylleH，KayoshiS，etal.Cellculturesastoolsinbiopharmacy［J］.EurJPharmSci，2000，11(Suppl2):51.
［2］关溯.Caco-2细胞模型—药物吸收研究的有效”工具”［J］.中国药理学通报，2004，20(6):609.
［3］MarkowskaM，OberleR，JuzwinS，etal.OptimizingCaco-2cellmonolayerstoincreasethroughputindrugintestinalabsorptionanalysis［J］.JPharmacolToxicolMethod，2001，46(1):51.
［4］王广基.药物代谢动力学［M］.北京:化学工业出版社，2005
［5］王琰，李正荣，潘飞燕，等.纳米脂质体包裹胰岛素经Caco-2细胞转运的研究［J］.中国药理学通报，2005，21(1):78.
［6］郭健新，平其能，董隽，等.醋酸亮丙瑞林脂质体及壳聚糖包衣脂质体经肠道及Caco-2细胞转运机制［J］.药学学报，2005，40(1):65.
［7］刘志伟.Caco-2细胞单层模型及其在毒理学中的应用［J］.卫生研究，2004，33(6):756.
［8］YeeS.InvitropermeabilityacrossCaco-2cells(colonic)canpredictinvivo(smallintestinal)absorptioninman-factormyth［J］.PharmRes，1997，14(6):763.
［9］杨海涛，王广基.Caco-2单层细胞模型及其在药学中的应用［J］.药学学报，2000，35(10):797.
［10］张向荣，张逸凡，张大放.体外Caco-2细胞模型在药物吸收中的应用进展［J］.中国医院药学杂志，2004，24(12):773.
［11］ArturssonP，KarlssonJ.Correlationbetweenoraldrugabsorptioninhumanandapparentdrugpermeabilitycoefficientsinhumanintestinalepithelial(Caco-2)cells［J］.BiochemBiophy，ResCommun，1991，175(3):880.
［12］KaekoMurota，SumieShimizu，etal.UniqueUptakeandTransportofIsoflavoneAglyconesbyHumanIntestinalCaco-2Cells:ComparisonofIsoflavonoidsandFlavonoids［J］.TheJournalofNutrition，2002，132:1956.
［13］ChureepornChitchumroonchokchai，MarkL.Failla.HydrolysisofZeaxanthinEstersbyCarboxylEsterLipaseduringDigestionFacilitatesMicellarizationandUptakeoftheXanthophyllbyCaco-2HumanIntestinalCells［J］.TheJournalofNutrition，2006，136:588.
［14］RaymondP.Glahn，DarrellR.VanCampen.IronUptakeIsEnhancedinCaco-2CellMonolayersbyCysteineandReducedCysteinylGlycine［J］.TheJournalofNutrition，1997，127(4):642.
［15］TakuyaSuzuki，HiroshiHara.VariousNondigestibleSaccharidesOpenaParacellularCalciumTransportPathwaywiththeInductionofIntracellularCalciumSignalinginHumanIntestinalCaco-2Cells［J］.TheJournalofNutrition，2004，134:1935.
［16］JeanelleBoyer，DanBrown，etal.InvitrodigestionandlactasetreatmentinfluenceuptakeofquercetinandquercetinglucosidebytheCaco-2cellmonolayer［J］.TheJournalofNutrition，2005，135:1.
［17］ShumeiYun，etal.AnInVitroDigestion/Caco-2CellCultureSystemAccuratelyPredictstheEffectsofAscorbicAcidandPolyphenolicCompoundsonIronBioavailabilityinHumans［J］.TheJournalofNutrition，2004，134:2717.
［18］RaymondP.Glahn，etal.Caco-2CellFerritinFormationPredictsNonradiolabeledFoodIronAvailabilityinanInVitroDigestion/Caco-2CellCultureModel［J］.TheJournalofNutrition1998，128(9):1555.
［19］ArturssonP，KarlssonJ.Correlationbetweenoraldrugabsorptioninhumanandapparentdrugpermeabilitycoefficientsinhumanintestinalepithelial(Caco-2)cells［J］.BiochemBiophy，ResCommun，1991，175(3):880.
［20］WooJS，LeeCH，ShimCK，HwangSJ.EnhancedoralbioavailabilityofpaclitaxelbycoadministrationoftheP-glycoproteininhibitorKR30031［J］.PharmRes，2003，20(1):21.
［21］MenonRM，BarrWH.TransportersinvolvedinapicalandbasolateraluptakeofceftibutenintoCaco-2cells［J］.BiopharmDrugDispos，2002，23(8):317.
摘要：中医经典良方四物汤及其单药主要活性成分当归多糖、地黄多糖、川芎嗪、芍药苷、阿魏酸等均具有一定的免疫调节作用，反映在对免疫器官骨髓造血和胸腺脾脏功能的改善，活化免疫细胞以及促进细胞因子分泌等方面。该文主要对近年来与其免疫药理相关的文献进行综述。
关键词：四物汤;活性成分;免疫调节
ProgressintheStudyontheImmunomodulatoryEffectofSiwuDecoctionanditsActiveComponents
Abstract:SiwuDecoctionanditsmainactivecomponentscanimproveimmunefunctionastraditionaldecoction.Theymayregulatehemopoiesis，affectimmunocyteactivityandpromotecytokinesecretionaswell.Thisreviewfocusesonthestudiesoftheirimmunomodulatoryeffectsinrecentyears.
Keywords:SiwuDecoction;Activecomponent;Immunomodulation
四物汤是中医经典良方，见于宋代《太平惠民和剂局方》，出自唐・蔺道人《仙授理伤续断秘方》，系《金匮要略》中的胶艾汤减去阿胶、艾叶、甘草而来，由熟地、当归、白芍、川芎四味单药组成。复方主要功用为补血活血。单药中熟地黄可滋阴补血、益精填髓，当归可补血活血，芍药能养血敛阴，川芎可活血行气、祛风止痛。四物汤具有调节机体免疫功能之功效，其作用与单药主要活性成分密不可分，现就其免疫药理研究进展综述如下。
1对免疫器官的影响
免疫器官主要包括骨髓、胸腺、腔上囊等中枢免疫淋巴样组织和脾脏、淋巴结、黏膜和皮肤相关的淋巴组织等外周免疫淋巴器官，它们的发育状况直接影响着机体免疫力。中枢免疫器官骨髓、胸腺是免疫细胞的发源地，造血干细胞在此发育分化为各类成熟的免疫细胞，所以四物汤及其单药的免疫调节功能与其补血活血功效密切相关。
1.1复方四物汤对免疫器官的影响四物汤能改善造血系统功能，升高血虚证小鼠骨髓有核细胞数及骨髓DNA量［1］，提高CD34+细胞在骨髓有核细胞中的比例，显著升高血虚证小鼠或辐射小鼠骨髓造血组细胞集落（CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-mix）形成单位数量［2~5］，提高正常小鼠的脾脏和胸腺指数［6，7］，对抗辐射和环磷酰胺所致的免疫器官脾脏和胸腺重量降低［3］。
1.2单药主要活性成分对免疫器官的影响熟地黄可显著促进正常小鼠骨髓造血干细胞（CFU-S）的增殖［8］。其主要有效成分地黄多糖能明显改善骨髓造血功能，拮抗衰老模型小鼠胸腺及脾脏的萎缩［9］，能显著提高经环磷酰胺处理后小鼠CFU-GM产率，可使经60Coγ射线照射小鼠的脾结节数明显增加［10］。当归主要活性成分当归多糖和阿魏酸，均能增加正常小鼠和血虚小鼠骨髓有核细胞数量，提高骨髓造血干/组细胞集落生成水平［11］，能促进60Coγ射线照射后小鼠内源性脾结节生成［12］；当归提取液和阿魏酸可明显增加正常小鼠脾脏和胸腺重量［13］；当归多糖能明显提高血淤证大鼠胸腺指数和脾指数，对抗氢化可的松引起的小鼠脾萎缩［14，15］。白芍活性成分主要是一组糖苷类物质，其中90%为芍药苷。梁乾德等［16］利用HPLC分析四物汤促进造血功能的主要成分即为芍药苷，芍药苷可促进放射线致血虚证小鼠骨髓造血干/组细胞的增殖显著升高。川芎主要成分为川芎嗪和阿魏酸，川芎嗪显著提高急性放射损伤后小鼠骨髓组织中单核细胞数量、巨核细胞数量和造血组织面积［17］。
2对免疫功能的影响
2.1对特异性免疫的促进作用
2.1.1细胞免疫细胞免疫是细胞介导的一种重要免疫反应，常用检测方法包括体内迟发型超敏反应（DTH）的检测和体外的T细胞计数，T细胞活化试验，细胞毒实验以及混合淋巴细胞反应（MLR）。四物汤能提高小鼠ANAE阳性细胞的百分率［6］。正常小鼠四物汤灌胃后迟发型超敏反应DTH值明显增高［7］。四物汤能显著促进自发性和ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖［18，19］。白芍总苷、川芎嗪、川芎多糖、当归液及阿魏酸、地黄等均能不同程度地促进小鼠淋巴细胞转化和增殖［20~22］。当归多糖对由亚适量ConA活化的小鼠胸腺细胞有明显促进增殖的作用，且体外可以拮抗氢化可的松对小鼠胸腺细胞增殖的抑制作用［15］，能明显增强小鼠对牛血清白蛋白诱发的迟发型超敏反应(DTH)［23］。地黄苷A可增强小鼠迟发性变态反应［24］。
2.1.2体液免疫体液免疫主要是由B细胞介导的另一种重要的免疫反应，通过分泌的免疫分子实现免疫功能，能防御细胞外微生物及其毒素。体液免疫功能的检测包括免疫球蛋白定量检测，常见抗体的检测以及B细胞数量和功能的检测。四物汤能提高小鼠抗体产生的滴度［6］。白芍总苷对LPS体外诱导的小鼠脾淋巴细胞(B细胞)增殖和对羊红细胞(SRBC)免疫小鼠脾淋巴细胞的抗SRBC抗体(溶血素)产生呈现低浓度促进和高浓度抑制的双向调节作用，对环磷酰胺引起的抗体减少或者增多有明显的拮抗作用［25］。当归和阿魏酸均能显著增加正常小鼠血清溶血素含量和抗体生成细胞数［13］。当归对辐射小鼠脾脏抗体形成细胞释放溶血素量、血清溶菌酶量、ANAE阳性淋巴细胞比率及红细胞C3b受体花环率均有不同程度的促进或提高作用。当归多糖对60Coγ射线照射小鼠ConA诱导的抗体产生能力明显增强［26］。地黄水煎液对类阴虚小鼠的脾脏B淋巴细胞功能有明显的增强作用［27］。地黄苷A能明显提高小鼠血清溶血素水平［24］。
2.2
非特异性免疫功能的促进作用
2.2.1白细胞及单核巨噬细胞系统白细胞与单核巨噬细胞系统细胞具有强大的吞噬能力，是参与机体非特异性免疫的重要部分，并能参与机体的特异性免疫。其功能提高主要是通过增加吞噬细胞数量和增强其吞噬能力来实现的。利用小鼠碳廓清试验可测定主体动物吞噬细胞的吞噬功能，也可利用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的数量体外观察其吞噬功能。四物汤能提高巨噬细胞吞噬鸡红细胞的百分率，表明四物汤可显著提高Balb/c小鼠巨噬细胞吞噬功能［6］。正常小鼠腹腔注射川芎嗪提高小鼠碳粒廓清能力［28］。腹腔注射白芍总苷可以提高小鼠腹腔吞噬百分率和吞噬指数［25，29］。当归多糖或者阿魏酸能明显提高小鼠单核巨噬细胞系统对碳粒（或染料）的廓清速率和腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能力［13］。
2.2.2细胞因子细胞因子是免疫活性细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞和其他相关细胞产生的一类蛋白性物质，在免疫细胞的增殖和活化，调节机体免疫功能中发挥重要作用。免疫相关的细胞因子主要包括白细胞介素类（IL），集落刺激因子（CSF），肿瘤坏死因子（TNF），干扰素（IFN），转化生长因子以及趋化因子等其他细胞因子。郭平等［5］实验发现四物汤能提高放射线致血虚证小鼠骨髓Epo和G-CSF基因表达，可促进ConA激活脾淋巴细胞分泌IL-6、IL2［19，30~31］。促进细胞脂多糖(LPS)激活巨噬细胞产生IL-1因子的活性［18］。高月等［2］利用生物芯片技术发现芍药苷可促进骨髓基质细胞(G-CSF，GM-CSF，PDGF-α，IL2，IL-9，IL-18)等基因表达，抑制造血抑制因子(MIP)的表达，通过细胞因子调控造血细胞。当归可通过保护和改善造血微环境，直接或间接地刺激造血微环境中的巨噬细胞、淋巴细胞、基质细胞等分泌较高活性的红系造血调控因子，粒单系集落刺激因子(GM-CSF)、IL-3等造血生长因子，促进人早期造血细胞发生［32］。当归对实验小鼠和60Coγ射线照射后小鼠ConA诱导的IL2的产生有明显促进作用［33］。在LPS刺激下，当归多糖能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α的功能［34］，当归多糖能诱导腹腔巨噬细胞产生NO及IL-1［35］。综上，四物汤的物质基础地黄多糖，当归多糖，阿魏酸，芍药苷，川芎嗪等活性成分，均不同程度地表现出免疫调节作用，其机理与促进骨髓造血、增加免疫细胞活性以及促进免疫分子分泌有关，四物汤的免疫调节作用来源于这些活性成分，而又非简单的效用叠加，对四物汤复方的作用机制和分子机理的研究仍待深入。基于中药化学、中药基因组学和蛋白组学理念，利用生物芯片和生物信息学技术，结合现代分子生物学研究手段，寻找中药复方的复合靶标，以求科学诠释中药的作用机理应该是一个可行的思路。
参考文献
［1］蒲春霞，方国璋.四物汤改善小鼠造血系统损害的实验研究［J］.中成药，2004，26(2):121.
［2］高月，马增春，谭洪玲，等.四物汤及其提取物对辐射致血虚证小鼠造血作用的研究［J］.天津中医药，2003，20(6):47.
［3］马增春，高月，刘永学，等.四物汤对环磷酰胺所致血虚证小鼠造血细胞作用的研究［J］.中国实验方剂学杂志2001;7（5）:13.
［4］HsuHY，HoYH，LinCC，ProtectionofmousebonemarrowbySi-WU-Tangagainstwholebodyirradiation［J］.JEthnopharmacol1996;52(2):113.
［5］郭平，梁乾德，胡剑江，等.四物汤对放射线致血虚证小鼠骨髓Epo和G-CSF基因表达的影响［J］.中国中药杂志，2005，30（15）：1173.
［6］白树平，龚传美，管喜文.四物汤对小鼠免疫功能的影响［J］.中药药理与临床，1998，14（2）:11.
［7］张玉杰，张建明，宋敏.四物汤对小鼠免疫功能的影响［J］.中国麻风皮肤，2004，20（6）:546.
［8］刘福君，程军平，赵修南，等.地黄多糖对正常小鼠干细胞、祖细胞及外周血象的影响［J］.中药药理与临床，1996，12(2):12.
［9］苗明三.（怀）地黄多糖对衰老模型小鼠免疫器官的影响［J］.河南中医，1999，19(3):30.
［10］刘福君，程军平，茹祥斌，等．地黄多糖对小鼠造血功能的影响［J］.中国药理学与毒理学杂志，1994，8(2)：118.
［11］张翠兰，文德鉴.当归对血液及造血系统药理作用研究进展［J］.湖北民族学院学报（医学版)，2002，19(4)：34.
［12］张晓君，祝晨，胡黎，等.当归多糖的免疫活性和对造血功能影响［J］.中药药理与临床，2002，18(5):24.
［13］高向东，吴梧桐.当归及其成分阿魏酸对小鼠免疫功能的影响［J］.中国生化药物杂志，1994，15(2):107.
［14］凌小曼，丁虹，罗顺德，等.当归多糖对血淤证动物免疫功能和抗氧化功能的影响［J］.中国医院药学杂志，2002，22(10)：584.
［15］杨铁虹，贾敏，梅其炳.当归多糖对小鼠免疫功能的调节作用［J］.中成药，2005，27(5)：563.
［16］梁乾德，路晓钦，马增春，等.四物汤促进造血功能成分的初步研究［J］.中国中药杂志，2004，29(6)：546.
［17］王琪，程德春，王磊.川芎嗪对荷瘤鼠化疗后免疫功能的影响［J］.齐齐哈尔医学院学报，2003，24(3)：243.
［18］曹尉尉，郑钦岳，王洪斌.四物汤对小鼠淋巴细胞增殖及巨噬细胞产生白细胞介素1的影响［J］.第二军医大学学报，1998，19(1):91.
［19］陈玉春，王碧英.四物汤刺激淋巴细胞3H-Tdr掺入及分泌IL2［J］.福建中医学院学报，1999；9(2)：34.
［20］刘锦蓉，强文安，叶松柏.川芎嗪对小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响［J］.华西医大学报，1995，26(2)：177.
［21］马学清.中药多糖的免疫增强作用［J］.中国实验免疫学杂志，1996，8(2):40.
［22］梁爱华，薛宝云，王金华，等.鲜地黄与干地黄止血和免疫作用比较研究［J］.中国中药杂志，1999，24(11):663.
［23］李明峰.当归多糖对小鼠免疫功能的影响［J］.第四军医大学学报，1987，8(6):422.
［24］王军，王震，李更生，等.地黄苷A对“阴虚”及免疫功能低下的小鼠的药理作用［J］.中国药学杂志2002，37(1):20.
［25］魏文树.白芍总甙对免疫应答的调节作用［J］.中国药理学通报，1987，3(3)：148.
［26］洪艳，张渝侯，王红玲，等.当归多糖对60Co照射小鼠免疫功能影响的研究［J］.中华医学杂志，2000，24(6):291.
［27］梁爱华，薛宝云，王金华，等.鲜地黄与干地黄止血和免疫作用比较研究［J］.中国中药杂志，1999，24(11):663.
［28］邝杏彩.丹参复方丹参川芎嗪增强小鼠免疫功能研究［J］.河北医学院学报，1991，12(3):140.
［29］梁君山.白芍总甙对大鼠腹腔巨噬细胞功能的影响［J］.中国药理学与毒理学杂志，199，6(2):153.
［30］郑钦岳，曹蔚蔚，曹颖瑛，等.四物汤增加小鼠脾细胞分泌IL-6及促进IL-6mRNA的表达［J］.第二军医大学学报，1998，19(3):290.
［31］曹蔚蔚，郑钦岳，林文.四物汤对小鼠脾细胞产生IL2的影响［J］.中国药理学会通讯，1998，15(4):3.
［32］郑敏，王亚平.当归多糖对人髓系多造血祖细胞增殖分化的影响及其机理研究［J］.解剖学杂志2002;25(2):105.
［33］吕世静，黄槐莲，吴宋厦.当归对实验动物红细胞黏附功能及IL2免疫调节作用［J］.中国实验临床免疫学杂志，1997，9(5):661.
【关键词】生物制药；动物细胞培养；应用
一、动物细胞的特点及生长特性
动物细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：①动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；②倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素；③培养过程需氧量少;④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；⑤原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡；⑥代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。
二、动物细胞大规模培养技术的发展
动物细胞大规模培养技术生产大分子的生物制品起始于20世纪60年代，当时是为了满足生产疫苗的需要。后来随着大规模培养技术的逐渐成熟和转基因技术的发展与应用，人们发现利用动物细胞大规模培养技术来生产大分子药用蛋白质比原核细胞表达系统更有优越性。因为重组DNA技术修饰过的动物细胞能够正常地加工、折叠、糖基化、转运、组装和分泌由插入的外源基因所编码的蛋白质，而细菌系统的表达产物则常以没有活性的包含体形式存在。随着大量永生性细胞株的创建，在商业利益的刺激下，动物细胞大规模培养技术也迅速发展起来，并被应用到生产实际。
动物细胞培养主要用于生产激素、疫苗、单克隆抗体、酶、多肽等功能性蛋白质，以及皮肤、血管、心脏、大脑、肝、肾、肠等组织器官。它在医药工业和医学工程的发展中占重要地位。大规模动物细胞培养生产药物产品将是生物制药领域的一个很重要的方面，具有重大的经济效益和社会效益。生物技术在过去10年有显著增长，并继续快速发展，今后几十年内还将有更多的蛋白质、抗体、多肽类药物由动物细胞培养来生产。随着生物技术的进一步发展，开发的动物细胞生产生物制品的种类的增多及产品周期短、安全高等优点，利用动物细胞进行大规模生产生物制品凸显其优越性的发展越来越快。
三、大规模细胞培养技术的应用
近几年来，已把巨大的人力和资金投入到开发大规模细胞培养技术上，将能加快发展步伐，进一步应用遗传修饰的哺乳动物细胞生产单克隆抗体和其他精细的糖蛋白。获得有药物作用的蛋白质是十分复杂的过程，要求分子有精确的折叠和糖基化，这些要求在细菌和酵母体内却难以得到满足。然而，采用杂交瘤和重组DNA技术往往可以使动物细胞产生和分泌出一定数量的有用蛋白质。大规模的动物细胞培养在药物产品的生产方面具有重大的价值。
1.疫苗
在疫苗产业早期，往往利用动物来生产疫苗，如用家兔人工感染狂犬病毒生产狂犬疫苗，用奶牛来生产天花疫苗，用某些细菌接种到动物身上来生产抵抗该种细菌的疫苗。早在20世纪50年代，已经能够利用动物细胞培养技术生产病毒。先在反应器中大规模培养动物细胞，待细胞长到一定密度后．接种病毒，病毒利用培养的细胞进行复制，从而生产大量的病毒。这一突破是动物细胞工程的真正开始。
虽然动物细胞培养技术发展迅速，大大降低了实验动物的用量，提高厂生产效率，但由于原代细胞增殖能力有限，一般只能通过简单增加动物的数量来增加产量。而使用具有无限增殖潜力的细胞系，则使疫苗的生产得到飞跃式的进展。某些来自人体或动物体内的细胞，在一定条件下的体外培养后，可以获得无限增殖的潜力，用它们来生产疫苗可以大大降低实验动物的用量。更为重要的是，用动物细胞体外大规模培养技术生产的疫苗可以保证质量，因为所用的细胞性质均一，经过严格的安全检验，克服了动物个体间的差异造成的疫苗质量不稳定的问题，并且大大降低了来自动物的病原体传染使用者的可能性。用类似的细胞培养技术可生产酶、细胞因子、抗体等生物制品，其先决条件是能够获得可分泌目标蛋白的细胞系。但是，在基因工程技术出现之前，细胞表达蛋白的水平很低，因而用这种工艺生产蛋白制品产量低、成本高，因此早期的动物细胞技术只用于疫苗及少量的干扰素和尿激酶的生产。基因重组技术和杂交瘤技术大大促进了动物细胞技术的进步及其在工业领域的应用，使动物细胞大规模培养技术在生产疫苗中越来越重要。
传统上一直把细胞培养产物用于人类和牲畜的病毒疫苗，这些疫苗至今己被大规模应用。口蹄疫疫苗是大规模动物细胞培养方法生产的主要产品之一。1983年，英国Wellcome公司就已能够利用动物细胞进行大规模培养生产口蹄疫疫苗。美国Genentech公司应用SV40为载体，将乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳动物细胞内进行高效表达，已生产出乙型肝炎疫苗。
2.单克隆抗体
单克隆抗体在体外诊断、体内造影、人和家畜的治疗以及工业上的应用日益广泛，需要量可达数百克。有些系统的单克隆抗体的需要量在今后几年内将迅速增加到几公斤的数量级。为此，迫切需要更有效的生产方法。采用传统方法(小鼠或大鼠的腹水瘤培养法)生产单克隆抗体，已不能适应实际需要。应用大规模细胞培养系统生产各种不同的单克隆抗体是经济可靠的方法。如英国Celltech公司采用10100和10001自动气升式培养系统，培养各种生产单克隆抗体的小鼠、大鼠和人的细胞株，生产各种单克隆抗体的产品。到目前为止，已成功地在1000L培养系统中，采用无血清培养液生产优质的单克隆抗体。其他一些国家先后制备成测定血和尿中的各种激素、特殊蛋白质、血型、各种药物、诊断细菌性或病毒性病原等的单克隆抗体诊断试剂盒。
3.基因重组产品
目前已认识到在不久将来用常规的微生物学方法不能实现遗传工程的效益，人们对大规模细胞培养的兴趣愈来愈大。动物细胞能精确地转译和加工较大或更复杂的克隆蛋白质。此外，动物细胞还可以把人们所需的蛋白质分泌到培养液内，而从培养液分离蛋白质要比细胞匀浆更为容易。除了单克隆抗体外，现在人们最感兴趣的蛋白质是组织型的血纤蛋白溶酶原激剂(t%26mdash;PA)，以及其他的重组分子。利用动物细胞培养方式进行大量生产，如免疫珠蛋白G、A和M，尿激酶，人生长激素，乙型肝炎表面抗原等产品均由美国Endotronic公司用Acusyst%26mdash;P型中空纤维培养系统进行生产。
参考文献
[1]林世康,胡云龙,施国民.动物细胞无血清培养基的应用及研究进展[J].细胞生物学杂志,2000年03期
趋化因子（chemokine）是一类一级结构相似，主要对白细胞具有化学趋化作用等多种生物学效应的小分子蛋白，在机体的防御和炎症反应等方面起着重要的调节作用。近年来，随着生物信息学和基础信息的发展，人们发现了许多新的趋化因子及其受体，特别是趋化因子受体被发现充当HIV感染的协同受体后［1］，趋化因子领域已经引起人们的广泛关注。到目前为止，已发现约50种人趋化因子［2］，其有如下生物学活性:（1）对各种细胞的趋化活性；（2）激活免疫活性细胞并参与炎症的免疫调节；（3）抗细菌和抵御变应原等功能；（4）造血细胞调控；（5）参与细胞生长、代谢和凋亡；（6）参与血管的修复和再生；（7）在肿瘤免疫及其转移中发挥重要作用［3］本文着重对趋化因子及其受体在系统性红斑狼疮（SLE）发生发展中的作用进行综述。
系统性红斑狼疮（SLE）是一种以自身抗体产生和免疫复合物形成为特点的自身免疫性疾病，自身抗体和免疫复合物（immunecomplexes，ICs）的沉积可引起多器官的炎症和损伤，组织损伤和功能失调主要通过免疫复合物的沉积和多种活性介质的直接作用而产生。涉及多种炎性介质和细胞间复杂的相互作用。其中趋化因子对特异白细胞的趋化和功能活化是启动与自身免疫反应有关的病变的关键步骤之一。
1趋化因子及其受体的结构和功能
1.1趋化因子自身免疫病的发生和慢性过程的维持依赖很多不同的机制，对外来抗原的正常免疫反应及宿主的自身免疫反应的病变基础是对白细胞的诱导募集和功能活化。这种诱导特定的白细胞的迁移和活化，参与炎症反应的一类细胞因子即趋化因子。同其他细胞因子的区别是趋化因子是细胞因子家庭中惟一的能与G蛋白耦联受体超家族结合的成员。
目前，随着分子生物学技术的发展和大规模人基因组测序和EST（expresssequencetag，EST）数据库的建立［4］，趋化因子的结构和功能及基因定位都已确定。它们都具有重要的结构特征，氨基酸的同源性为20％～70%，是一类非常丰富的系统。所有趋化因子具有相似的一级结构，一般在N末端都含有4个保守的半胱氨酸残基，此区域是受体活动的重要区域。N末端修饰的趋化因子影响趋化因子受体的活性。据N末端半胱氨酸残基的相对位置，分为4个家庭。其中两个与SLE有关的趋化因子家族包括CC类趋化因子和CXC类趋化因子。（1）CC类趋化因子（β趋化因子），N末端2个Cys之间无任何氨基酸。CC趋化因子主要作用于单核巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及NK细胞，诱导它们的迁移和功能活化。目前的研究表明，CC类趋化因子与多种炎性疾病，如慢性炎症、自身免疫性疾病、HIV感染等相关联。（2）CXC类趋化因子（α趋化因子），N末端Cys中的第一个与第二个之间含有任意一个氨基酸。此类趋化因子主要对中性粒细胞具有强大的趋化和功能活化作用，也作用于淋巴细胞。另外的趋化因子家族还包括只有2个Cys残基的C类趋化因子和CX3C类趋化因子、病毒基因编码的趋化因子等。如RANTES可以和CCR1CCR3CCR5结合［5］。
1.2趋化因子受体趋化因子介导白细胞的迁移是通过与靶细胞上各自的受体的有规律的相互作用完成的。不同的白细胞对趋化因子的反应不同取决于这些细胞表面趋化因子受体的表达。目前已明确有20多种趋化因子受体。他们属七次跨膜转运G蛋白耦联受体超家族，主要表达于骨髓来源的各白细胞亚群，同时也表达于上皮细胞、血管内皮细胞、神经细胞等类型的细胞上。主要包括CC类趋化因子受体和CXC类趋化因子受体。一种趋化因子受体可以与几种趋化因子结合，一种趋化因子也可以和不同的趋化因子受体结合。这表明趋化因子除趋化白细胞外，还具有很多其他生物学活性。例如细胞表面特定的受体的表达影响着这些细胞对人类免疫缺陷病毒HIV-1感染的易感性和迁移方式。有些受体如CCR2、CCR3、CCR5、CXCR4，尤其CCR5是HIV1感染人体不可缺少的主要协同受体。而CC趋化因子RANTES、MIP-1α和MIP-1β可以阻断CD4+细胞介导的HIV-1的感染。进一步的深入研究，趋化因子受体有可能成为某些白细胞亚群的表面标志物和某些疾病治疗的靶点。
2趋化因子及其受体在疾病中的表达
2.1趋化因子各种自身免疫性炎性疾病通常是最初的对特定自身抗原的强免疫反应。组织损伤的病变基础是趋化因子介导的白细胞的诱出和功能活化。几乎任何改变细胞稳定的因素的刺激，如前炎性细胞因子IL-1和TNF-α、IFN-γ、细菌产物脂多糖、病毒感染等都能诱导趋化因子的分泌，然后趋化因子募集特定的白细胞达到炎症区域，执行各自的功能，这种作用在防御微生物感染和创伤修复等是非常有用的。然而，趋化因子的高水平的持续的不适当的表达，也会使募集的白细胞大量增加形成破坏性的损伤。另外，白细胞介导的损伤又使趋化因子高水平表达或使其他类型的趋化因子表达增加，产生更广泛的组织损伤，这样使白细胞对机体的保护作用被破坏而引起疾病。大量研究表明SLE患者肾组织中MCP-1、IP-10、IL-8、MIP-1α、RANTES等表达增加［6］。
2.2趋化因子受体事实上，无论机体正常与否，趋化因子受体都会表达于某些细胞的表面，也即白细胞表面抗原，只是表达的量上有所不同。它们属七次跨膜转运G蛋白耦联受体超家族，主要表达于骨髓来源的各白细胞亚群，同时也表达于上皮细胞、血管内皮细胞、神经细胞等类型的细胞上。
3趋化因子及其受体在SLE中的作用
SLE是一种全身性的自身免疫病，通常是多器官受累。其中狼疮性肾炎(LN)是SLE病人较常见的最严重的并发症和死亡的主要原因之一。
3.1浸润于狼疮性肾炎病人肾组织中的细胞狼疮性肾炎病人肾功能失调主要是由于肾小球损伤引起的，白细胞的浸润是这种炎性疾病的一种表现。在狼疮肾炎病人的肾小球中浸润的细胞主要是巨噬细胞，T淋巴细胞很少，而在组织间隙主要是T淋巴细胞，其次是巨噬细胞。这表明这些细胞在狼疮肾炎的发生和发展中起着重要的作用。
3.2趋化因子及其受体在组织损伤中的作用很多自身免疫病都以淋巴细胞和单核巨噬细胞浸润为主，随着趋化因子对特异白细胞的募集和在组织中更进一步的聚集和活化形成破坏性的损伤。虽然受损组织中浸润的细胞成分主要依赖于疾病的活动情况，但主要与这些细胞所表达的趋化因子受体和组织内产生的趋化因子的种类有关。
3.3肾组织中趋化因子的来源及其对白细胞的迁移、趋化作用不同的肾实质细胞和浸润于肾组织的细胞都可以产生趋化因子。肾实质细胞如肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞、肾小球上皮细胞在IL-1、TNF-α、IFN-γ等作用下可产生MCP-1、MIP-2、RANTES、IP-10、IL-8等趋化因子。外周血白细胞向肾组织的迁移是在趋化因子作用下，白细胞与血管内皮细胞之间的协调作用的结果。肾组织在前炎性介质等的作用下，肾实质细胞产生的趋化因子吸引血循环中特异白细胞沿着趋化因子浓度梯度向肾组织迁移，刺激血管内皮细胞表达黏附因子，使白细胞易与血管内皮黏附，并使血管内皮的通透性增加，促使白细胞外渗于肾组织间隙。
3.4趋化因子及其受体在SLE狼疮性肾炎肾组织损伤中的作用单核细胞和T淋巴细胞浸润于肾组织介导肾组织损伤。炎症中单核细胞和T淋巴细胞聚集于肾小球及组织间隙，活化的单核巨噬细胞可产生IL-1、TNF-α等细胞因子，这些产物刺激肾实质细胞如肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞、肾小球上皮细胞等产生促进肾组织损伤的活性物质，包括趋化因子、巨噬细胞集落刺激因子、细胞因子等。进一步扩大了肾组织的炎症反应和损伤。受损的肾实质细胞持续释放趋化因子形成一个浓度梯度，与趋化因子受体特异的结合、解离，形成一个反复的动态过程，以吸引特异的白细胞沿着趋化因子浓度梯度向肾组织单向迁移，造成更严重的损伤。表现为肾小球肾炎、肾小管萎缩、组织间隙纤维化。严重的发展为肾功能衰竭。
3.4.1MCP-Ⅰ的作用趋化因子MCP-1的受体有CCR2、CCR4、CCR8等，它由肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞等产生。对单核巨噬细胞具有强大的趋化和活化作用，对活化的CD4+T细胞也具有相似的作用。并促进SLE病人T细胞的活化。在小鼠（对狼疮易感小鼠［7］MRL/FAS1pr鼠和MZB×MZW鼠）实验性肾小球肾炎、人狼疮肾炎的肾组织中MCP-1增加。MCP-1能介导肾小管和肾小球的损伤。在前炎性细胞因子IL-1、TNF-α、γ-IFN等和循环性IgG免疫复合物作用下，肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞可以产生MCP-1，趋化单核细胞迁移进入肾组织，使肾组织中巨噬细胞增加。单核巨噬细胞经MCP-1作用活化后，分泌溶酶体酶、细胞因子，并产生超氧阴离子等造成肾组织局部损伤。超氧阴离子能促进肾实质细胞MCP-1mRNA表达。在MCP-1和其惟一的受体CCR2基因敲小鼠的狼疮肾炎模型中，MCP-1缺乏小鼠对单核细胞的趋化作用减弱，单核细胞向肾组织的迁移降低，对肾小管具有保护作用，但并不能阻止肾小球的损伤，从侧面说明了MCP-1在狼疮肾炎中的作用。应用MCP-1抗体在上述模型中对肾小球和肾小管都具有保护作用。Noris等［8］对活动性狼疮性肾炎患者的血清及尿中MCP-1水平进行了检测，发现活动性狼疮性肾炎患者尿MCP-1水平显著高于非活动期患者和健康对照者.而且，非狼疮性肾小球肾炎患者尿中MCP-1水平与健康对照者相比差异无显著性.另外，多项研究表明，SLE患者血清中MCP-1浓度高于正常健康人，而且其浓度随疾病活动性进展而增加，随疾病恢复而降低。这些结果均提示检测SLE患者血清及尿液中MCP-1水平可以反映SLE的活动性。动物模型研究中，Zoja等［9］从mRNA的表达水平阐明了小鼠狼疮肾炎中肾脏MCP-1mRNA的表达水平随着肾炎的进展而显著增加，而且与单核细胞的浸润程度呈正相关。Hase［10］等发现活动期SLE患者外周血CD4+T细胞上CCR4表达高于健康对照和非活动期患者，而且其与疾病活动指数记分呈显著正相关，皮质类固醇治疗后CCR4、血清中抗ds-DNA和疾病活动指数记分均明显下降。另外，他们还发现活动期SLE患者血清中IL-10水平有所增加，且与CCR4表达显著相关。这些均TH2免疫应答在SLE患者活动期有重要作用，且CCR4表达与SLE患者的病程有相关性。
3.4.2RANTES的作用趋化因子RANTES的受体有CCR1、CCR3、CCR5等，它由肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞产生。几乎与MCP-1一样对单核细胞具有强大的趋化活性，但作用不如MCP-1强。也能作用于T淋巴细胞，并介导这些细胞的活化。RANTES能促进迁移的白细胞与肾小球基质成分的黏附、聚集并促进自身免疫性肾损伤。在狼疮肾炎易感鼠MRL/FAS1pr中，肾损伤发生之前肾组织中RANTES表达即增加［10］。除作用于单核巨噬细胞外，RANTES还可以促进不同的T细胞亚群在肾组织中浸润，辅助并促进肾组织的损伤。应用RANTES的受体阻断剂能显著抑制淋巴细胞的浸润。梁鸣等［11］报道在狼疮性肾组织中RANTES在肾小球及肾小管均呈高水平表达，与肾小球细胞数、狼疮活动指数肾间质损害程度及24h尿蛋白定量呈正相关，与Cor呈负相关；王建有［12］报道，RANTES在SLE患者与健康对照组间、SLE活动与非活动间均无明显差异。出现这种不同结论原因，可能是所研究样本发病特点不同，累及器官不同，存在不同的Th1／Th2紊乱。
3.4.3MIP-1的作用趋化因子MIP-1的受体有CCR1、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8等，它由肾组织中活化的巨噬细胞和肾小管上皮细胞产生，经羟基磷酸灰石层析可将MIP-1分为MIP-1α和MIP-1β。MIP-1α较MIP-1β有更强的趋化和活化单核细胞作用，但不如MCP-1作用强。MIP-1也作用于T淋巴细胞。MIP-1α主要作用于CD8+T细胞，而MIP-1β主要作用于CD4+T细胞。在细胞免疫反应和体液免疫反应造成的损伤中起着重要的作用。
3.4.4IP-10的作用趋化因子IP-10属CXC趋化因子家族，它的受体为CXCR3。在IFN-γ的作用下，肾小球系膜细胞可产生IP-10。NarumiS［13］等报道在SLE病人血中IP-10明显增加，并与抗DNA抗体呈正相关。IP-10与SLE疾病的活动情况有关，可能在SLE的发病中起着重要的作用。IP-10主要作用于Th1类细胞，在Th1类细胞介导的细胞免疫肾损伤中起着重要的作用。
4展望与设想
研究趋化因子及其受体在SLE中的作用，已经成为研究SLE发病机理的重要途径。由于趋化因子间的相互影响及趋化因子的作用受控于受体的表达，受到其受体在不同免疫细胞、淋巴细胞亚群上及不同组织上的不同水平的表达调节。所以，同时研究多个趋化因子及其受体在不同免疫细胞上的表达与SLE发病的关系，才能更好理解趋化因子在SLE发病中的作用。随着对趋化因子及其受体的深入研究可能还会有更多的趋化因子和受体被发现。他们对免疫细胞的作用和在疾病中的病理生理学作用也会被揭示。
由于趋化因子与其受体之间并非一一对应的关系，这其中存在着纷繁复杂的网络状系统，使得更清晰的阐明趋化因子及其受体的精确的生理及病理生理作用成为难点，阻断一种趋化因子及其受体很难达到阻断炎症的发生发展。Mantovani［14］提出趋化因子系统的“缜密性（robustness）”使人们对趋化因子之间的调节有了进一步的认识，但离趋化因子用于疾病的治疗还相差甚远。多项动物学试验均表明阻断某一种或几种趋化因子及受体的确能够对疾病的缓解有很大的作用，随着对多种趋化因子及受体以及他们的关系研究的进一步深入，不久的将来，趋化因子及其受体可能成为疾病治疗的靶点。目前，趋化因子阻断剂、受体拮抗剂和受体抗体作为治疗的分子正在研究中，并取得了令人注目的进展，CCR2受体拮抗剂（spiropiperidines）是特异和强大的MCP-1与CCR2结合的抑制剂［15］。针对趋化因子的和受体拮抗剂的深入研究有望对SLE、肿瘤、艾滋病、各种炎症疾病等进行治疗。所以深入细致研究趋化因子及其受体在不同免疫细胞上表达的变化与SLE发病的关系，对控制和治疗SLE具有深远的意义，从而达到治疗狼疮的目的。
参考文献
1FiresteinGS，YeoM，ZvaiflerNJ.Apoptosisinrheumatoidarthritissynovium.JClinInvest，1995，96:1631-1638.
2NathSK，KilpatrickJ，HarleyJB.Geneticsofhumansystemiclupuserythematosus:theemergingpicture.CurrOpinImmunol，2004，16:794-800.
3GerardC，RollinsBJ.Chemokinesanddiseas.NatImmunol，2001，2(2):108-115.
4BelmontHM，AbramsonSB，LieJT.Pathologyandpathogenesisofvascularinjuryinsystemiclupuserythematosus.ArthritisRheum，1996，39:9-22.
5HolcombeRF，BaethgeBA，WalfRF，etal.Correlationofseruminterleukin-8andcellsuifacelysosome-associatedmembraneproteinexpressionwithclinicaldiseaseactivityinsystemiclupuserythematosus.Lupus，1994，3(2):97-102.
6WadaT，YokoyamaH，SuSB，etal.Monitoringurinarylevelsofmonocytechemotacticandactivatingfactorreflectsdiseaseactivityoflupusnephritis.KidneyInt，1996，49:761-767.
7HaseK，TaniK，ShimizuT，etal.IncreasedCCR4expressioninactivesystelupuserythematosus.JLeukocBiol，2001，70(5):749-755.
8NorisM，BernasconiS，CasiraghiF.etal.Monocytechemoattractantprotein-1isexcretedinexcessivamountsintheurineofpatientswithlupusnephritiLabInvest，1995，73(6):804-809.
9ZojaC，CornaD，BenedettiG，etal.Bindaritretardsrenaldiseaseandprolongssurvivalinmurinelupusautoimmunedisease.KidneyInt，1998，53(3):726-734.
10MooreKJ，WadaT，BarbeeSD，etal.GenetrabsferofRANTESelicitsautommunerenalinjuryinMRL-Faslprmice.kidneyIntemational，1998，53，1631-1641.
11梁鸣.RANTES在狼疮性肾组织中的表达及其意义.中华风湿病学杂志，2002，6:161-164.
12王建有.系统性红斑狼疮患者几种趋化因子检测.中华皮肤科杂志，2002，35:20-21.
13NarumiS，TakeuchiT，KobayashiY，etal.SerumleveisofifrrinduciblePROTEIN-10reatingtotheactivityofSystemiciupuserythematosus.Cytokine，2000，12(10):1561-1565.
目的探讨髓系细胞触发受体1(TREM1)在氧化型低密度脂蛋白胆固醇(oxLDL)诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞中的表达情况。方法先后用PMA、oxLDL诱导人U937细胞，使其转化为泡沫细胞。用RTPCR法及Western印迹法检测PMA诱导组、低密度脂蛋白（LDL）组和oxLDL组细胞中TREM1mRNA及蛋白的表达。结果与PMA诱导组、PMA+LDL组细胞比较，PMA+oxLDL组细胞TREM1mRNA及蛋白表达水平均明显增高（P
【关键词】泡沫细胞；髓系细胞触发受体1；动脉粥样硬化
泡沫细胞是动脉粥样硬化（AS）斑块内出现的特征性病理细胞，主要来源于血液单核细胞与血管中膜平滑肌细胞。越来越多的泡沫细胞堆积在一起形成脂质条纹乃至脂质斑块。U937是一种人淋巴瘤细胞，本质是单核细胞，体外细胞培养呈悬浮生长，经佛波酯刺激后可以分化为巨噬细胞样细胞，后者在含氧化型低密度脂蛋白胆固醇（oxLDL）的培养液中培养可转化为泡沫细胞〔1〕。髓系细胞触发受体1（triggeringreceptorexpressedonmyeloidcells1，TREM1）是一个30ku的糖蛋白，能诱使多种炎性因子和化学因子如肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素8（IL8）和单核细胞趋化蛋白1（MCP1）的生成。因此，TREM1在调节中性白细胞和单核细胞的激活过程及炎症反应中处于较重要地位。但有关TREM1在单核细胞源性泡沫细胞中表达情况未见报道。本研究用PMA及oxLDL诱导U937细胞向泡沫细胞转化，用RTPCR及Western印迹法探讨TREM1在此过程中的表达情况。
1材料与方法
1.1细胞来源及主要试剂
U937细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司，系人单核细胞系，倍增时间为24～48h，在含10%小牛血清RPMI1640培养基中呈悬浮样生长。
oxLDL由Yuanyuanbiotechnology提供。佛波酯购自Sigma公司。RPMI1640培养基和Trizol购自Gibco公司。MMLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶、10mmol/LdNTP、Oligo（dT）购自Fermentas公司。小鼠抗人TREM1单克隆体为Abnova公司产品，兔抗人GAPDH抗体为SantaCruz产品。ECL发光试剂盒为Millipore公司产品。其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2U937细胞的分化及诱导
呈对数生长的U937细胞（细胞密度1.0×109/L），加入终浓为100nmol/LPMA，孵育72h，使其由单核细胞分化为巨噬细胞样U937细胞。用无血清培养液培养12h后，换成含oxLDL(终浓度为100mg/L)的培养液继续培养24h，将上述巨噬细胞样U937细胞诱导为泡沫细胞。
1.3油红O染色法鉴定U937泡沫细胞
将贴壁生长的细胞用新鲜配制的0.3％油红O染色20min，苏木素染色5min，70％乙醇脱色及返蓝后，水溶性胶封片，镜下观察结果。
1.4实验分组
将经PMA诱导的U937细胞平均分为3组，分别为PMA诱导组，PMA+低密度脂蛋白（LDL）组和PMA+oxLDL组。每组设5个孔，分别用正常含10%小牛血清的RPMI1640培养液、含LDL终浓度为100mg/L的培养液及含oxLDL终浓度为100mg/L的培养液培养24h，收集培养细胞进行RTPCR检测及Western印迹检测。
1.5RTPCR法检测培养细胞中TREM1mRNA的表达
按Trizol说明书提取培养细胞总RNA，按逆转录酶提供的说明书进行逆转录反应。取逆转录模板2μl用于PCR，反应条件为cDNA预变性94℃5min后，经94℃30s，55℃30s；72℃30s共30个循环；循环结束后再72℃延伸10min。反应结束后取PCR产物进行2%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml溴化乙锭）电泳，紫外灯下照相，用凝胶成像处理系统对每一样品PCR产物扩增的特异性片段进行积分光密度扫描。以GAPDH密度作参考定量标准，各组光密度与其比值表示表达量强弱。
根据GenBank提供数据设计引物。TREM1引物上游序列为5′TGCTGTGGATGCTCTTTGTC3′，下游序列为5′CACAGTTCTGGGGCTGGTAT3′，扩增片段长度为491bp；GAPDH引物上游序列为5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，下游序列为5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′，扩增片段长度为452bp。以上引物均由上海捷瑞公司合成，用TE缓冲液稀释成终浓度为15pmol/L，-20℃贮存备用。
1.6Western印迹法检测培养细胞中TREM1蛋白的表达
将培养细胞用细胞裂解液收集并充分裂解后，进行10%SDSPAGE电泳，电转膜，丽春红染色，观察转膜效果；以PBST洗膜15min，共4次，室温下2%脱脂奶粉封闭1h；分别加适当稀释的一抗（TREM1按1∶500稀释，GAPDH按1∶2000稀释）4℃孵育过夜；PBST洗膜15min，共4次，加二抗（HRP标记的羊抗鼠IgG）室温2h；PBTS充分洗膜，用ECL试剂盒化学发光检测，GAPDH为内对照，用图像分析仪分析各组条带光密度值。
2结果
2.1泡沫细胞的形态学鉴定
U937细胞经过PMA诱导72h后，倒置显微镜下观察，多数细胞由圆形变成多角形，并易于聚集、贴壁，表明细胞已由单核细胞分化后具有巨噬细胞样特征。经oxLDL油红染色后可见培养细胞明显显示出泡沫样改变，胞浆内较多的脂滴颗粒存在，且发现由于个别细胞吞噬了过多脂滴而致细胞体积增大（见图1），而未加oxLDL的对照组细胞及LDL对照组细胞内无明显脂滴颗粒。
2.2TREM1mRNA及TREM1蛋白在泡沫细胞中的表达
RTPCR结果显示，TREM1扩增产物为492bp。结合Western印迹结果显示，与PMA组及PMA+LDL组比较，PMA+oxLDL组TREM1mRNA及TREM1蛋白表达量明显增加（P
3讨论
AS是一个复杂的炎症免疫反应病理过程，AS斑块中含有包括单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞、oxLDL负载的巨噬细胞（即泡沫细胞）和T淋巴细胞等炎性反应细胞浸润〔2〕。病变早期的泡沫细胞多来源于血中的单核细胞，后者进入内皮下转变为巨噬细胞，其表面的特异性受体可与oxLDL结合，从而摄入大量胆固醇，成为泡沫细胞。同时，巨噬细胞吞噬oxLDL形成泡沫细胞时可生成血管内皮生长因子（VEGF）、TNFα等细胞因子，这些因子在AS的发生发展中起着关键作用〔3，4〕。近年来的研究发现，肺炎衣原体、幽门螺杆菌、巨细胞病毒等病原体通过激活炎症反应及损伤内皮而促进冠心病的发生发展〔5〕，提示AS与感染性疾病的发病机制可能密切相关。
TREM1属免疫球蛋白超家族成员，能显著放大由脂多糖（LPS）等细菌产物引发的急性炎症反应，在感染性休克发生中具有重要作用，因而引起越来越多研究者的关注。研究表明，TREM1不仅与细菌感染相关的急性炎症有关，在一些病毒感染性炎症、非特异性慢性炎症、缺血再灌注损伤、烧伤、甚至肿瘤的复发及预后判断方面都有重要作用〔6，7〕。
U937本质上是人单核细胞，经佛波酯、oxLDL刺激后可以分化为巨噬细胞样细胞，进而转化为巨噬细胞源性泡沫细胞。U937的这一特性使其成为体外研究泡沫细胞形成机制的重要工具。本研究用RTPCR法及Western印迹法对U937向泡沫细胞转化过程中TREM1mRNA及蛋白表达情况进行检测，结果发现单核细胞在向泡沫细胞转化过程中表达量不断增加，提示TREM1参与泡沫细胞的形成，可能与AS斑块的发生发展密切相关。因此TREM1可能成为AS治疗的一个新的靶点或监测AS进展的一项新指标。
参考文献
1YueHH，LengN，WuZB，etal.ExpressionofCD147onphorbol12myristate13acetate(PMA)treatedU937cellsdifferentiatingintofoamcells〔J〕.ArchBiochemBiophys，2009；485(1):304.
2GalkinaE，LeyK.Immuneandinflammatorymechanismsofatherosclerosis〔J〕.AnnuRevImmunol，2009；27(1):16597.
3毛节明，王广.动脉粥样硬化与炎症〔J〕.中国循环杂志，2006；21(6):4056.
4朱建华.动脉粥样硬化炎症机制新视点〔J〕.同济大学学报(医学版)，2009；30(2):69.
5朱建健，王宪.慢性炎症、自身免疫和动脉粥样硬化〔J〕.生理科学进展，2002；33(4):32731.
【摘要】目的:研究γ射线与LPS协同激活小鼠巨噬细胞RAW264.7的效应机制，以及γ射线与LPS诱导钙结合蛋白S100A8的表达及意义。方法:相差显微镜观察细胞形态;流式细胞计数方法检测细胞周期及活性氧介质（ROI）水平;Griess颜色反应测定细胞NO水平;实时定量RTPCR方法检测细胞S100A8mRNA水平的表达。结果:γ射线与LPS作用于RAW264.7细胞引起细胞形态改变，部分细胞出现非整倍性，少量细胞出现凋亡，胞内ROI水平、NO水平明显升高，S100A8分子mRNA水平明显升高，而且这些效应几乎都比γ射线或LPS单因素的作用要强。结论:γ射线与LPS协同诱导巨噬细胞激活是细胞周期改变、信使分子水平变化、炎症因子如S100A8的表达等多方面生物效应的综合结果，其中S100A8基因的表达与巨噬细胞功能状态密切相关。
【关键词】巨噬细胞;γ射线;LPS;S100A8
巨噬细胞在整个免疫反应中起极为重要的作用，辐射后许多组织和器官损伤都涉及到巨噬细胞的功能异常，巨噬细胞的辐射效应一直受到重视。巨噬细胞通常具有辐射抗性，但已有多篇报道证明电离辐射能够促进或直接激活巨噬细胞。一氧化氮（nitricoxide，NO）的生成是巨噬细胞被激活的重要标志，单纯的射线不能引起小鼠巨噬细胞J774.1和RAW264.7细胞中NO水平的改变，但0.5～10Gy射线预处理能够触发这些巨噬细胞为干扰素γ（interferonγ，IFNγ）和（或）脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导生成NO，而且呈现剂量效应关系［1］。
钙结合蛋白S100A8是S100蛋白家族成员，是一个多功能分子，其最主要的功能是参与免疫炎症反应过程［2］。Stassen等［3］研究发现，6GyX射线照射MCF7细胞后48～72h，S100A8被诱导表达，其mRNA水平呈现辐射剂量效应关系。静息态的巨噬细胞不表达S100A8，激活状态的巨噬细胞才表达S100A8分子，S100A8在巨噬细胞中为LPS等炎症因子诱导表达［4］。既然S100A8能够为电离辐射及LPS诱导表达，那么我们需要进一步研究在巨噬细胞中，电离辐射是否与LPS协同诱导S100A8以及S100A8的表达与巨噬细胞功能状态之间的关系。本研究观察比较了RAW264.7细胞受10Gyγ射线照射后24h，5mg/LLPS继续处理24h与正常对照、相应单纯γ射线或单纯LPS处理组细胞形态、周期、活性氧介质（reactiveoxygenintermediates，ROI）水平、NO水平及S100A8mRNA等指标的改变并探讨相互之间的关系。
1材料和方法
1.1材料试剂LPS、2’7’二氯荧光素双醋酸盐(2，7dichlorofluorescindictate，DCFHDA)、碘化丙啶(propidiumiodide，PI)为美国Sigma公司产品。RPMI1640培养基干粉、胎牛血清、TRIzol试剂为美国Invitrogen公司产品。随机引物、MMLV逆转录酶为美国Promega公司产品。BioEasySYBRGreenIRealTimePCRKit为杭州博日公司产品。FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司产品。Linegene荧光定量PCR检测系统为杭州博日公司产品。
1.2方法
1.2.1RAW264.7细胞培养及处理小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞于含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液，37℃、50mL/LCO2饱和度条件下培养。对数增殖期细胞照射前24h，换新鲜培养基，不辐射或10Gy60Coγ射线照射，照射后24h，不加或加入5mg/LLPS，继续培养24h。相差显微镜观察细胞形态变化。
1.2.2流式细胞术测定细胞周期乙醇固定骨髓单细胞悬液，PI染色，流式细胞仪检测，具体按文献［5］进行。
1.2.3流式细胞术测定ROI水平约1×106RAW264.7细胞铺种于6孔板中，培养过夜，γ射线或(和)LPS处理后不同时间收集细胞，用无血清RPMI1640培养液洗2遍细胞后，20μmol/LDCFHDA悬浮细胞，37℃孵育30min，无血清RPMI1640培养液洗涤1遍后，0.5mL无血清RPMI1640培养液悬浮细胞，流式细胞仪检测。
1.2.4NO水平检测通过Griess颜色反应测定细胞培养上清中NO-2水平，NO-2水平以吸光值A550表示，具体方法参照文献［1］进行。
1.2.5实时定量RTPCR检测S100A8表达用TRIzol试剂提取RAW264.7细胞总RNA，经紫外分光仪检测A260和A280，测定浓度和纯度。取总RNA2μg，随机引物0.5μg，MMLV逆转录酶200U，进行25μL体系反转录。每PCR反应取2μL反转录产物为模版，加入BioEasySYBRGreenIRealTimePCRKit试剂，于荧光定量PCR检测系统进行实时定量PCR扩增测定CT（Treshholdcycle）值。小鼠S100A8上游引物5′ATCACCATGCCCTCTACAAGA3′，下游引物5′TGCTACTCCTTGTGGCTGTCT3′。看家基因3磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase，GAPDH）上游引物5′CCATGGAGAAGGCCGGGG3′，下游引物5′CAAAGTTGTCATGGATGACC3′。用比较CT方法，以看家基因GAPDH为内参，以未处理正常细胞中S100A8mRNA水平为1，相对定量γ射线或(和)LPS处理后S100A8mRNA的表达水平。相对表达倍数=2^(-CT)，其中CT=γ射线或(和)LPS处理样品的CT-正常对照的CT，CT=S100A8的CT-GAPDH的CT。
1.2.6统计学分析所有数据均以x±s表示，应用SAS9.13统计软件进行两因素析因设计资料的方差分析。
2结果
2.1RAW264.7细胞形态学改变观察比较RAW264.7细胞受10Gyγ射线照射后24h，5mg/LLPS继续处理24h与正常对照、相应单纯γ射线或单纯LPS处理组细胞形态学变化，可见正常RAW264.7细胞为圆形，贴壁生长;单纯γ射线或单纯LPS处理的细胞变大，部分细胞伸出伪足、呈梭形，胞内颗粒增多，两种处理细胞形态学改变类似;γ射线与LPS共同作用的细胞变得更大，胞内大量颗粒物，巨噬细胞呈现被激活状态。
2.2RAW264.7细胞倍性、凋亡的改变正常未处理的RAW264.7细胞中非整倍性（aneuploid）细胞、凋亡细胞百分数均为0%;10Gyγ射线照射后24h，5mg/LLPS继续处理24h及相应单纯γ射线或单纯LPS处理条件下，细胞均出现部分非整倍性细胞;而只在γ射线与LPS共同作用条件下，细胞才出现明显凋亡（图1）。
2.3RAW264.7细胞胞内ROI水平的改变观察10Gyγ射线照射后0～24h胞内ROI水平的动态变化，照后即刻开始升高，6h达高峰，24h基本恢复到正常水平（图2），可见胞内ROI早期生成明显，随后下降，因此我们比较细胞受各种处理后6h，胞内ROI水平的改变。单纯10Gyγ射线照射后30h（即10Gyγ射线照射后24h，0mg/LLPS继续处理6h），胞内ROI水平不变;单纯5mg/LLPS处理后6h（即0Gyγ射线照射后24h，5mg/LLPS继续处理6h），胞内ROI水平升高;10Gyγ射线照射后24h，5mg/LLPS继续处理6h，胞内ROI水平明显升高，从测定数值看，明显高于单纯5mg/LLPS处理后6h或单纯10Gyγ射线照射后胞内ROI的水平（图3，图2）。图210Gyγ射线照射后0～24h胞内ROI水平的变化
2.4RAW264.7细胞NO水平的变化单纯γ射线照射，胞内NO水平不变;单纯LPS处理条件下，与正常对照相比，胞内NO水平升高;10Gyγ射线照射后24h，5mg/LLPS继续处理24h，胞内NO水平明显升高，而且高于单纯LPS处理组，表明γ射线能够促进LPS增强巨噬细胞RAW264.7中NO水平（图4）。
2.5RAW264.7细胞中S100A8分子mRNA表达水平的改变实时定量RTPCR方法检测胞内S100A8mRNA水平的变化。以未处理正常细胞中S100A8mRNA水平为1，单纯10Gyγ射线处理条件下，胞内S100A8mRNA水平为9.0±2.3;单纯5mg/LLPS处理条件下，胞内S100A8mRNA水平为86.0±8.3;10Gyγ射线与5mg/LLPS共同作用条件下，胞内S100A8mRNA水平为630.0±70.8。可见，γ射线、LPS均可诱导巨噬细胞RAW264.7中S100A8mRNA表达，LPS的作用强于γ射线，而且γ射线与LPS具有协同作用。
3讨论
我们的研究表明，RAW264.7细胞受10Gyγ射线照射后24h，5mg/LLPS继续处理24h条件下，γ射线与LPS共同作用影响细胞多方面的生物学效应，具体表现为细胞体积明显变大，胞内大量颗粒物，呈现被激活状态;部分细胞呈现非整倍性，少量细胞出现凋亡;胞内ROI水平、NO水平明显升高;S100A8分子mRNA水平明显升高，而且这些效应几乎都比γ射线或LPS单因素的作用要强。
γ射线与LPS共同作用使RAW264.7细胞形态改变，胞内大量颗粒物的出现可能反应了细胞酶活性的改变。我们检测了RAW264.7细胞受0～40Gyγ射线照射后0～72h细胞倍性、周期、凋亡的改变，发现随时间、剂量不同，细胞周期呈动态改变，但细胞几乎不出现凋亡，只在γ射线与LPS共同作用条件下细胞才出现凋亡，一定程度说明细胞具有辐射抗性;部分细胞呈现非整倍性，而且这部分细胞DNA含量为正常未处理细胞的两倍，非整倍性的出现可能与细胞分裂受到抑制、细胞功能的改变或细胞分化状态相关。
ROI和DNA损伤是辐射信号转导中的主要信使分子。我们观察到0～40Gy射线照射后6h，RAW264.7细胞胞内ROI水平随照射剂量增加呈现增强趋势，LPS能引起胞内ROI水平升高，而且射线的预处理大大增强了LPS引起细胞ROI水平升高的效应。已有的研究表明，0～10Gyγ射线照射后24h，RAW264.7细胞的DNA损伤随受照剂量增加而增强［6］。在射线促进IFNγ引起J774.1细胞中NO生成的过程中，第二信使是DNA损伤而非ROI［1］。
S100A8能够为辐射诱导表达，紫外线诱导小鼠表皮角化细胞中S100A8的表达，ROI参与了此过程［7］。此外，大鼠肝部受20Gy射线照射后6hS100A8蛋白水平升高，而且该分子的诱导表达可能与受辐射后肝部ROI水平升高有关［8］。我们的研究发现，单纯γ射线或单纯LPS处理条件下，RAW264.7细胞中S100A8mRNA水平升高，而且γ射线与LPS具有协同作用。我们还检测了通常与S100A8形成复合物行使生物学功能的S100A9分子mRNA的表达，未能检测到各种处理条件下该分子的表达及变化，这与已有报道的研究结果一致［3，4，7，8］，说明S100A8本身具有功能特异性。我们的预实验表明，ROI及转录因子激活蛋白1(activatorprotein1，AP1)可能参与了辐射诱导RAW264.7细胞中S100A8表达的过程。S100A8与炎症反应密切相关，那么S100A8诱导表达可能与RAW264.7细胞活性增强有关。此外，S100A8/A9复合物及S100A8、S100A9具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的功能［9］，γ射线与LPS能够增强RAW264.7细胞中S100A8表达、引起该细胞凋亡，两者之间是否存在某种关联还需要进一步的实验验证。
参考文献
［1］IbukiY，MizunoS，GotoR.γIrradiationinducedDNAdamageenhancesNOproductionviaNFkappaBactivationinRAW264.7cells［J］.BiochimBiophysActa，2003，1593(2-3):159-167.
［2］GebhardtC，NémethJ，AngelP，etal.S100A8andS100A9ininflammationandcancer［J］.BiochemPharmacol，2006，72(11):1622-1631.
［3］StassenT，PortM，NuykenI，etal.RadiationinducedgeneexpressioninMCF7cells［J］.IntJRadiatBiol，2003，79(5):319-331.
［4］HsuK，PasseyRJ，EndohY，etal.RegulationofS100A8byglucocorticoids［J］.JImmunol，2005，174(4):2318-2326.
［5］董波，陈肖华，张浩，等.一种改进的用于测定细胞周期的细胞制备方法［J］.军事医学科学院院刊，2002，26(2):124-129.
［6］TokuzumiS，HoriM，MonobeM，etal.EffectofnitricoxideonγrayinducedmicronucleusfrequencyinRAW264.7cells［J］.RadiaRes，2005，164(6):723-732.
［7］GrimbaldestonMA，GeczyCL，TedlaN，etal.S100A8inductioninkeratinocytesbyultravioletAirradiationisdependentonreactiveoxygenintermediates［J］.JInvestDermatol，2003，121(5):1168-1174.
[关键词]地榆总皂苷；造血细胞增殖；巨核细胞分化；白细胞介素3；白细胞介素3受体；干细胞因子受体
地榆总皂苷（DYS）促造血作用已从体内外研究中获得证实[1]，作者前期的研究发现[2]，DYS可单独或协同细胞因子促进造血细胞增殖，尤其，DYS单独处理能显著增加依赖促血小板生成素（TPO）生长的Baf3/Mpl细胞增殖，且在mRNA水平促进TPO受体（TPOR）的表达。Baf3/Mpl细胞源自于小鼠髓系巨核祖细胞系Baf3，后者依赖IL-3生长。通过转入TPOR后，Baf3细胞也可依赖TPO生长，因此命名为Baf3/Mpl细胞。尽管已证实DYS单独能促进Baf3/Mpl细胞增殖，且与上调TPO受体表达水平有关，但Baf3/Mpl细胞也表达IL-3受体，DYS的促增殖作用与IL-3受体是否也有关联，尚值得进一步探索。本研究采用未经Mpl受体转染的Baf3亲本细胞在加入或缺乏IL-3的体外培养条件下，观察地榆总皂苷对细胞生长的影响，同时研究了地榆总皂苷对IL-3受体表达的影响；另选择了依赖IL-3生长的32D小鼠髓系祖细胞系，研究了地榆总皂苷的促增殖作用，并观察了DYS诱导巨核细胞分化的作用以及对干细胞因子受体c-kit表达的影响，为进一步探索促造血的多效性奠定基础。
1材料
1.1地榆总皂苷制备取干燥地榆（购自成都市五块石药材市场，并由成都中医药大学贾敏如教授鉴定为地榆SanguisorbaofficinalisL.）粉碎成粗粉，称取500g并加入10倍量95%乙醇浸泡30min，回流提取3次，每次60min，尼龙布过滤；合并提取液，减压过滤得透明微红色液体，减压回收乙醇，加水混悬，保温至60℃，乙酸乙酯趁热萃取，连续3次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，即得地榆总皂苷粗提物。HPLC测定地榆皂苷I质量分数大于70%。使用前用DMSO溶解，无菌PBS稀释至1g・L-1，待用。
1.2试剂与仪器RPMI1640培养基（Gibco）；新生胎牛血清（HyClone）；重组小鼠白介素3（mIL-3，Sigma公司）；一步法RT-PCR试剂盒（Takara）；二氧化碳培养箱（Sanyo公司）；普通光学显微镜和倒置相差显微镜（Olympus公司）；多功能酶标仪（PerkinElmer公司）。
2方法
2.1细胞及细胞培养依赖IL-3生长的Baf3细胞和32D细胞系均购买自ATCC。细胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，IL-3（2μg・L-1）参照说明补充加入培养体系中。
2.2细胞增殖测定Baf3和32D细胞维持培养在对数生长期，用无血清培养基洗涤3次，悬浮于含0.5%胎牛血清的无细胞因子培养基中，次日以适量细胞数分别接种于96孔培养板内，分别设置空白对照组、地榆总皂苷单独处理组、IL-3单独处理组、地榆总皂苷+IL-3处理组。用无IL-3、无血清培养基稀释地榆总皂苷溶液，按照设置浓度加入细胞，使其终质量浓度分别为5，10，20，30，40mg・L-1，IL-3浓度参照细胞维持生长所需浓度加入。细胞在37℃条件下连续培养至指定时间，采用CCK8试剂盒并参照说明书提供的方法进行细胞增殖检测。
2.3Giemsa染色和巨核细胞计数Baf3和32D细胞分别接种于6孔板中，采用较高质量浓度（40mg・L-1）的DYS分别处理2种细胞，Baf3细胞在DYS处理120h后涂片用甲醇固定5min，Giemsa染色10min，染色后的标本用缓冲液洗涤，晾干，显微镜观察其形态学变化；32D细胞在DYS处理9d后光学显微镜下以细胞核内分裂分类计数100个细胞中的多倍体巨核细胞数，分类以双核为4N，4核为8N，依此类推。
2.4RT-PCR检测Baf3细胞和32D细胞分别接种在6孔培养板，加入地榆总皂苷溶液（10mg・L-1），37℃条件下继续培养，分别于24，48，72h收获细胞，用Trizol试剂提取总RNA。参照RT-PCR试剂盒扩增细胞内目的基因，各基因引物均由作者设计，上海基康生物技术有限公司合成，引物序列及产物片段大小见表1。IL-3R与c-kit扩增条件均为逆转录（RT）：50℃30min；94℃2min；PCR扩增条件：94℃15s，48℃15s，72℃45s，24～26个循环；最后延伸72℃10min，4℃1h。同时设置内参基因GAPDH的扩增，循环数为24，其余同目的基因扩增。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并拍照，同时采用半定量方法（目的基因/GAPDH）计算目的基因表达水平。
2.5统计学方法数据分析采用SPSS17.0统计软件包处理，实验数据均以±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析。
3结果
3.1DYS对Baf3细胞增殖的影响Baf3细胞在缺乏IL-3培养条件时，细胞增殖明显受抑制，但在含IL-3的培养条件下，Baf3细胞增殖明显，证实Baf3细胞依赖IL-3生长；在不含IL-3的培养条件下加入DYS（10mg・L-1）后，Baf3细胞数量也明显增加，并呈时间依赖；在含IL-3的培养条件下加入DYS（10mg・L-1），Baf3细胞数量增加更为明显，并优于IL-3单独刺激的细胞增殖结果。为了证实DYS的浓度依赖关系，进一步的研究结果显示：在不加IL-3的条件下，DYS促进细胞增殖的作用仅在20mg・L-1范围内，超过此浓度范围，细胞增殖减弱并呈现抑制细胞增殖的作用，但观察到细胞胞体变大的现象，见图1。
3.2DYS对32D细胞增殖的影响另采用依赖IL-3生长的32D细胞，证实了DYS促细胞增殖的作用。32D细胞在缺乏IL-3培养条件时，细胞增殖明显受抑制，但在含IL-3的培养条件下，32D细胞增殖明显，证实32D细胞依赖IL-3生长；在不含IL-3的培养条件下加入DYS（10mg・L-1）后，32D细胞数量明显增加，并呈时间依赖，此结果与在Baf3细胞中观察到的结果一致，见图2。
32D细胞依赖IL-3生长，加入IL-3后，细胞快速增殖并聚集成簇，形成明显的细胞团，该成簇生长的特征反映了32D细胞增殖的最佳状态。通过32D细胞加入IL-3后成簇生长的特征，评价了DYS单独促32D细胞增殖的能力。对照细胞在缺乏IL-3或DYS的条件下，细胞逐渐死亡，在培养第9天，仅有单个散在的活细胞存在，且数量非常有限；而加入DYS的细胞明显聚集成簇，与IL-3加入后形成的细胞团相同，但聚集成簇的细胞团略小于加入IL-3的细胞，此结果进一步证实了DYS的促造血生长作用，见图3。
3.3DYS对32D细胞分化的影响为了证实DYS诱导巨核细胞分化的作用，在缺乏IL-3的培养条件下，采用20mg・L-1的DYS单独处理细胞，在第4天和第9天经Giemsa染色，见图4，结果显示：与培养第4天的对照细胞相比，DYS单独处理细胞后第4天，多倍体巨核细胞数量增加，且胞体变大；培养至第9天细胞大部分死亡，仅剩胞体变大的细胞。经Giemsa染色并记录不同倍体巨核细胞的百分率，结果显示：在缺乏IL-3的条件下培养9d，2N细胞几乎全部死亡，4～32N巨核细胞数明显增加，DYS处理细胞中的4N细胞明显减少，但8～32N细胞明显增加，其中16N细胞增加尤其明显，为对照细胞的2.3倍。此结果初步证实地榆具有促进巨核祖细胞成熟分化的作用，见图5。
3.4DYS对Baf3细胞mIL-3受体表达水平的影响Baf3细胞表达mIL-3受体并依赖IL-3生长，DYS是否能上调mIL-3受体的表达，值得进一步研究。采用RT-PCR技术，研究了地榆总皂苷对IL-3受体mRNA表达水平的影响，结果显示，DYS单独处理Baf3细胞48h后，IL-3受体mRNA水平明显增加，但72h后下降至对照水平，见图6。
3.5DYS对32D细胞c-kit表达水平的影响c-kit为干细胞因子受体，在巨核祖细胞向成熟分化过程中发挥了重要作用。因此，进一步检测了DYS对32D细胞的c-kit表达的影响。与对照细胞比较，DYS单独处理细胞后能明显上调c-kit的表达，此结果提示地榆总皂苷也能通过上调巨核祖细胞c-kit表达而发挥促巨核细胞增殖和分化的作用，见图6。
4讨论
前期研究发现地榆总皂苷能单独或增强TPO刺激的Baf3/Mpl细胞增殖，且能显著增加TPO受体表达水平。Baf3/Mpl细胞源自于Baf3细胞，前者通过转入TPO受体Mpl后依赖TPO因子生长。本研究中，采用了无外源性Mpl表达并依赖IL-3生长的Baf3细胞以及依赖IL-3生长的32D细胞，评价了地榆总皂苷的促造血增殖作用。在缺乏IL-3的条件下，地榆总皂苷能明显促进Baf3细胞和32D细胞增殖，表明DYS可不依赖TPO和IL-3而促进巨核祖细胞的增殖。此外，延长DYS处理32D细胞的时间，可明显增加16～32N巨核细胞数量，证实DYS单独处理细胞不仅可促其增殖，而且具有促其向巨核细胞成熟分化的作用。
早期认为，巨核细胞增殖以及分化成熟主要受巨核细胞祖细胞集落刺激因子（MK-CSF）和促血小板生成素（TPO）的双水平调节。随后对小鼠和人类巨核细胞的体外研究表明，巨核细胞生成受多种体液因子的多水平调节，包括IL-3，IL-6和EPO细胞因子。近来研究证实，在造血干细胞和祖细胞中，干细胞因子（SCF）及其受体c-kit对巨核细胞增殖、分化和产生血小板的影响较其他细胞更为显著[3-4]。DYS促进巨核祖细胞增殖以及分化的作用可能与其他受体如IL-3受体和c-kit有关。据此，进一步在mRNA水平研究了DYS对2种受体表达的影响，结果发现DYS确能上调2种受体的表达。
IL-3受体属于Ⅰ型造血细胞因子受体超家族[5]，由特异性α链和β链构成，其α链与IL-3结合形成低亲和受体异二聚体，随后与β链结合形成高亲和受体复合物，导致β链的磷酸化并激活相应的信号转导途径[6-8]。IL-3受体主要在骨髓细胞中表达，与IL-3结合后可促进多种造血细胞增殖，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨核细胞、红细胞以及B细胞[9]。本研究发现DYS在无外源性IL-3的作用下可促进需依赖IL-3生长的2种巨核细胞增殖，同时上调细胞IL-3R的表达，这提示DYS可能具有拟IL-3的作用，包括促进巨核细胞等多种造血细胞的增殖及成熟。另有研究表明，IL-3不仅可直接作用于造血细胞，还可通过协同干细胞因子（SCF）及其受体c-kit，经一系列反应激活下游信号转导通路，从而调节骨髓巨核细胞的增殖与分化。且多篇文献报道，激活SCF-c-kit通路在抗肿瘤药物损伤后的造血恢复过程中可表现出良好的血小板恢复作用[3-4]。由此推测DYS对IL-3R和c-kit表达水平的上调是其发挥促巨核祖细胞增殖和分化的重要机制之一。同时，结合前期研究结果，DYS可不依赖TPO或IL-3而促进Baf3/Mpl，Baf3，32D细胞生长，表明DYS具有明显的多效细胞因子作用。
由于本研究中DYS为地榆总皂苷提取物，DYS中除含有地榆皂苷I单体成分外，尚含有多种其他成分，进一步区分DYS中皂苷及非皂苷类成分的作用，尤其研究不同单体成分对巨核祖细胞增殖及分化的作用将具有更为重要的价值和意义。
[参考文献]
[1]高小平，吴建明，邹文俊，等.地榆促造血作用的有效部分筛选[J].中国天然药物，2006，4（2）：137.
[2]邹文俊，刘芳，吴建明，等.地榆总皂苷促造血细胞增殖效应研究[J].中草药，2012，43（5）：929.
[3]DiVirgilioA，BiffoniM，DeMariaR，etal.Preventionofchemotherapy-inducedanemiaandthrombocytopeniabyconstantadministrationofstemcellfactor[J].ClinCancerRes，2011，17（19）：6185.
[4]ZeunerA，SignoreM，MartinettiD，etal.Chemotherapy-inducedthrombocytopeniaderivesfromtheselectivedeathofmegakaryocyteprogenitorsandcanberescuedbystemcellfactor[J].CancerRes，2007，67（10）：4767.
[5]ChenJinglong，OlsenJane，FordSally，etal.Anewisoformofinterleukin-3receptorαwithnoveldifferentiationactivityandhighaffinitybindingmode[J].JBiolChem，2009，284（9）：5763.
[6]StomskiFC，SueQ，BagleyCJ，etal.Humaninterleukin-3（IL-3）inducesdisulfide-linkedIL-3receptorα-andβ-Chainheterodimerization，whichisrequiredforreceptoractivationbutnothigh-affinitybinding[J].MolCellBiol，1996，16（6）：3035.
[7]AlgatePA，SteelmanLS，MayoMW，etal.Regulationoftheinterleukin-3（IL-3）receptorbyIL-3inthefetalliver-derivedFL5.12cellline[J].Blood，1994，84（9）：2459.
[8]ShearerWT，RosenwasserLJ，BochnerBB，etal.Biologyofcommonβreceptor-signalingcytokines：IL-3，IL-5，andGM-CSF[J].MolMechanAllerClinImmun，2003，112（4）：653.
[9]SunQY，WoodcockJM，RapoportA，etal.Monoclonalantibody7G3recognizestheN-terminaldomainofthehumaninterleukin-3（IL-3）receptorα-ChainandfunctionsasaspecificIL-3receptorantagonist[J].Blood，1996，87（1）：83.
EffectoftotalsaponinsfromSanguisorbaofficinalison
megakaryocyteprogenitorcellsproliferation，differentiationand
relativereceptorexpression
DAIYan-ping，GAOXiao-ping，WUJian-ming，LIXiang，HUANGFei-hong，ZOUWen-jun*
（ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，Chengdu610075，China）
[Abstract]Objective：ToinvestigatetheeffectsoftotalsaponinsfromSanguisorbaofficinalis（DYS）onhematopoieticcellproliferation，differentiationandtheexpressionlevelofIL-3Randc-kit.Method：Baf3and32DcellswereculturedwithorwithoutIL-3，thenthecellswereexposedtoDYSindifferentconcentrationsof5，10，20，30and40mg・L-1for24，48，72and96hoursseparately.Afterthat，thecellproliferationanddifferentiationcapacityweredeterminatedbythemethodsofCCK8andGiemsastainingseparately.TheeffectsofDYSontheexpressionlevelofIL-3receptorinBaf3cellsandtheexpressionlevelofc-kitin32DcellsweredeterminatedusingRT-PCR.Result：DYSpromotesaloneproliferationofBaf3cellsand32Dcellsafter48h.Incontrasttocontrolcells，32DcellscontainingDYSwithoutIL-3formmanylargeclusters.DYSalsoincreasestheproliferationwhenculturedwithIL-3.HighconcentrationofDYSinducealonethedifferentiationof32Dcellsandincreasealonethenumberofthepolyploidymegakaryocyte.Moreover，DYSincreasesalonetheexpressionlevelofIL-3RinBaf3cellsandtheexpressionlevelofc-kitin32Dcellsseparately.Conclusion：OurdatashowsDYScanpromotealoneproliferationanddifferentiationofmegakaryocyteprogenitorcells.TheproliferativeanddifferentiativeeffectofDYSonmegakaryocyteprogenitorcellsiscorrelatedtotheup-regulationofIL-3receptorandc-kitexpression.
【关键词】双功能抗体IL-2膀胱癌LAK细胞
中国图分类号:R737.14文献标识码:A文章编号:1005-0515(2010)08-064-02
Studyoncooperativeactionofbispecificantibody(anti-humanbladder
cancer/anti-CD3)andIL-2oncytotoxicityofLAKcells
【Abstract】ObjectiveTostudyanewmethodforimprovingtherapeuticeffectonhumanbladdercarcinoma.MethodsCytotoxicityofLAKcellsagainstbladdercancercellsenhancedbybispecificantibody(anti-humanbladdercancer/anti-CD3)andIL-2wasexamined,comparingwithcontrolgroups.ResultsCytotoxicityofLAKcellsagainstbladdercarcinomacellscouldbemarkedlyenhancedbybispecificantibodycomparedwithanti-CD3andanti-humanbladdercancermonoclonalantibody.WhenLAKcellsincubatingwithIL-2,itscytotoxicityenhancedbybispecificantibodywashigher.ConclusionBispecificantibodyandIL-2couldmarkedlyenhancecytotoxicityofLAKcellsagainstbladdercancercells.
【KeyWords】BispecificantibodyInterleukin-2;Bladdercancer;Lymphokineactivatedkillercells
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,以美国为例,2002年有56500例新诊病例[1]。目前以双功能抗体(Bispecificantibody,BsAb)为代表的主动免疫生物治疗,被称为肿瘤治疗的第四模式,是近年来较有希望的一种特异性免疫疗法[2]。抗人膀胱癌/抗CD3双功能抗体能同时识别T淋巴细胞亚群上CD3分子和膀胱移行细胞癌(以下简称:膀胱癌)细胞膜表面相关抗原的抗体,它既能激活T淋巴细胞及增强其细胞毒活性,又有特异性地将活化的T淋巴细胞引导至膀胱癌细胞,并产生细胞毒作用。IL-2是LAK细胞所必需的细胞因子,具有增强LAK细胞,激活其细胞毒性的作用[3]。本实验对IL-2在抗人膀胱癌/抗CD3双功能抗体的细胞毒性中的作用进行了研究。
1..材料与方法
1.1材料
抗人膀胱癌的单克隆抗体腹水,吉林大学第二医院馈赠。抗CD3的单克隆抗体腹水,由吉林大学基础医学院免疫教研室提供。按辛酸-硫酸胺法纯化,参照Nitta的方法[5]。
取已纯化的抗人膀胱癌的单抗,放柠檬酸缓冲液中透析过夜,按酶:单抗=1:4(w/w)加入胃蛋白酶作用18小时,滴加1mol/L的NaHCO3使反应物pH值为8.0,终止酶反应。SephadexG-150凝胶柱层析,核酸蛋白仪280nm波长监测蛋白峰,收集器分段收集抗体的F(ab`)2片段后,聚乙二醇适当浓缩。CD3单抗F(ab`)2片段的制备同上。
取抗人膀胱癌的单抗的F(ab`)2片段,加入终浓度为0.5mmol/L的二硫苏糖醇(DTT,购自Sigma),37℃作用30分钟。SephadexG-25凝胶柱层析,225nm监测并分段收集Fab`片段,适当浓缩。同样方法收集CD3单抗Fab`片段。
取CD3单抗Fab`片段,加入终浓度为0.5mmol/L的双功能偶联剂5,5`-二硫代-双2硝基苯酸(DTNB,购自Sigma),37℃作用30分钟后SephadexG-25凝胶柱层析,225nm监测,并分段收集CD3单抗Fab`片段与DTNB反应所得的Fab`-NB片段。将抗人膀胱癌的单抗的Fab`和CD3单抗Fab`-NB片段按1:1混合,37℃反应4小时,反应物用SephadexG-150凝胶柱层析,280nm监测,分段收集杂合的F(ab`)2片段,测定双抗浓度后,置-20℃冰箱保存。
1.2.效靶细胞的制备
取正常人和膀胱癌病人(术后病理确诊)的静脉肝素抗凝血50ml,淋巴细胞分离液常规分离出单核细胞,RPMI1640液洗一次,放入含终浓度为1000U/mlIL-2的RPMI1640(含10%小牛血清)培养液中,置37℃5%CO2培养箱中诱导72小时。
以人膀胱癌BIU-87细胞[6]作为靶细胞,用RPMI1640(含10%小牛血清)培养液传代培养。
1.3.细胞毒性的检测
如表1分组。分别收集BIU-87细胞1×106,RPMI1640洗后,加入6.4×105Bq的3H-TdR,培养4小时,Hanks液洗涤二次,RPMI1640调细胞浓度为1.25×105/ml。
收集LAK细胞,用RPMI1640洗后,按效、靶细胞10:1调LAK细胞浓度为1.25×106/ml。取96孔培养板,每孔加LAK细胞100μl,加终浓度为1μg/ml的双抗50μl,实验组加入终浓度为100U/ml的IL-225μl,对照组加入RPMI164025μl,37℃5%CO2培养箱中诱导4小时后每孔加入已标记好的BIU-87细胞100μl,培养箱中作用18小时,然后弃上清液,每孔再加0.25%胰蛋白酶50μl,20分钟后,用收集器将细胞收集在49#玻璃纤维滤片上,37℃烘干,加闪烁液置液闪仪中测定cpm值。以RPMI1640+靶细胞为空白对照组。取4样本均值计算细胞毒活性,公式为:
细胞毒活性(%)=(1-实验组cpm/空白对照组cpm)×100%。
1.4.统计学方法
采用t检验,P
2..结果
见表1。来源于健康人的LAK细胞毒性,加IL-2的实验组与对照组比较均有显著性差异(P
3..讨论
随着分子生物学和免疫技术的飞速发展,双功能抗体的研制成为热点,它作为一种新的二次导向系统在临床治疗中具有潜在的应用价值[7]。迄今已得到许多有价值的双功能抗体产物,并已进入临床应用[8]。抗人膀胱癌/抗CD3双功能抗体的一臂能利用抗CD3单抗的功能,激活T淋巴细胞的增殖活化,并增强其细胞毒性,活化的T淋巴细胞上的IL-2受体表达进一步增强后,加入IL-2,可引起机体各杀伤效应细胞的一系列活化反应;另一臂能利用抗人膀胱癌单抗具有与膀胱癌细胞膜表面抗原相结合的作用,将这些效应杀伤细胞特异地导向膀胱癌细胞,并对其进行杀伤,且这种杀伤作用是非MHC限制的[9],故能解决单纯使用LAK细胞和IL-2治疗所出现的问题,如LAK细胞为广谱和多克隆杀伤细胞,对膀胱癌细胞缺乏特异性和体内运用时不能被增殖及活化等。
本研究结果提示,不同来源的LAK细胞,单独加入抗人膀胱癌单抗或抗CD3抗体后,再加入IL-2,LAK细胞毒性均有显著提高;当抗人膀胱癌单抗或抗CD3抗体混合加入后,再加入IL-2,其细胞毒性虽有显著提高,但与单独加入抗人膀胱癌单抗或抗CD3抗体的作用相比并没有显著的差异;双抗和IL-2作用后的细胞毒性,显著高于任何单一抗体及二者混合物。说明双抗的作用并不是二种单抗作用的简单相加,可能与双抗的特异导向功能有关。另外,加入单抗、双抗等增强因子后,膀胱癌患者的LAK细胞对BIU-87细胞的体外杀伤作用低于正常人的LAK细胞,提示抗人膀胱癌/抗CD3双功能抗体如果使用于临床,还需加用其它免疫增强剂,才有可能时患者的免疫状态恢复到正常人的水平。
膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤,初发时80%为表浅癌,治疗后易复发,且复发后20-30%将进展为浸润癌[10]。这种高发病趋势及易复发进展的特性决定了早期诊断和术后合理有效治疗的重要性。通过本实验,我们认为抗人膀胱癌/抗CD3双功能抗体与IL-2的合用,可能是膀胱癌综合治疗的有效途径之一。
参考文献
[1]Laufer.M,Ramalingam.S,Schoenberg.MP,et.al.Intrave
sicalgemcitabinetherapyforsuperficialtransitionalcellcarcinomaofthebladder:aphaseIandpharmacokineticstudy[J].JClinOncol,2003,21:697-703.
[2]LuD,JimenezX,ZhangH,etal.Di-diabody:anoveltetravalentbispecificantibodymoleculebydesign.JImmunolMethods,2003,279:219-232.
[3]TrichieriG.Interleukin-2andtheregulationofinnateresistanceandadaptiveimmunity[J].NatRevImmunol,2003,3:133-146.
[4]范海涛,刘禄成,淳,等.抗人膀胱癌抗独特型抗体的制备和鉴定.临床泌尿外科杂志,2002,17:553-555.
[5]NittaT,YagitaH,AzumaT,etal.BispecificF(ab`)2monomerpreparewithanti-CD3andanti-tumormonoclonalantibodiesismostpotentofcytolysisofhumanTcells.EurTImmunol,1989,19:1437.
[6]刘禄成,郭航,范海涛,等.抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体制备及体外效应研究.中国免疫学杂志.2003,19:605-606.
[7]ZuoZ,JimenezX,WitteL,etal.AnefficientroutetotheproductionofanIgG-likebispecificantibody.ProteinEng,2000,13:361-367.
[8]操敏,唐家琪.双功能基因工程抗体在不同系统中表达的研究进展.微生物学和免疫学进展,2000,28:77-80.
“细胞工程”是人教版新课程教材《生物选修3•现代生物科技专题》的教学内容,根据操作对象的不同,可分为植物细胞工程和动物细胞工程两大领域。本部分内容是从细胞水平和分子水平了解植物细胞工程和动物细胞工程。细胞的全能性是植物细胞工程的基础,植物组织培养技术是植物细胞工程的基本技术手段,是植物体细胞杂交与单倍体育种的基础。动物细胞培养技术是核移植、细胞融合与单克隆抗体等技术手段的基础。本部分内容以必修1中的细胞学、必修2中的遗传学,以及必修3中的内环境与稳态等知识为基础,为“胚胎工程”、“生物技术的安全性和伦理问题”的后续学习打下了基础,共同构成一个相对完整的知识体系。
〖学生分析〗
高二的学生已经掌握了一定的生物学基础知识,具备了一定独立思考和判断的能力,合作性学习能力也比较强,但是个体之间仍然存在着较大的差异。
〖重、难点分析〗
1.植物组织培养是本节的重点
分析:植物组织培养重点讲述植物组织培养技术和基本原理,即离体培养的植物细胞脱分化和再分化过程,不仅在知识上对细胞结构、功能、细胞增殖、细胞分化进行深化和扩展,而且还为培育无病菌植株、制备人工种子及植物体细胞杂交等提供技术支持。同时,随着科学技术的不断进步,植物组织培养这门新技术将日益普及和深入,成为现代农业生产中的重要技术手段。
2.植物体细胞杂交是本节的难点
分析:植物体细胞杂交是在植物组织培养技术的基础上,借助动物细胞融合的方法发展起来的一门新型生物技术。这部分知识对于学生来说是全新的,因此应用表格和动物细胞融合比较学习。
3.单克隆抗体是本节的重点、难点
分析:动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、核移植等。其中动物细胞培养是其他技术(单抗、细胞融合、核移植等)的基础,其价值更多是通过其他技术成果来体现的。而动物细胞融合技术是目前较成熟的、其最重要的用途便是制备单克隆抗体。可见单克隆抗体应列为本节的重点内容,同时单克隆抗体技术本身环节多,技术复杂,因此也列为本节的难点所在。
〖设计理念〗
从新旧知识联系入手,进一步深入学习细胞全能性理论,并在学习过程中,渗透对学生能力和学习方法的培养;充分利用学生现有的知识,借助于多种直观教学手段,特别是多媒体课件,使学生对植物体细胞杂交和单克隆抗体由点及面的学习;智能训练,实现知识的正向迁移。
〖教学目标〗
1.知识目标
(1)细胞全能性(理解)。
(2)植物细胞工程的主要技术――植物组织培养和植物体细胞杂交(知道)。
(3)动物细胞工程的主要技术――动物细胞培养、动物细胞融合、核移植(知道)、单克隆抗体(知道)。
2.道德目标
通过向学生介绍几大动植物细胞工程技术的发展动态及一些新的研究成果,使学生明确人们对生命奥秘的揭示愈加广泛和深入,知识不断更新并向前发展。认识到学无止境,形成终生学习的意识。
3.能力方面
在教学过程中,合理利用图表、流程图等,培养学生的观察能力、思维能力以及整合、运用科学信息的能力;通过联系生产实际,培养学生活学活用,理论联系实际的能力。
〖教学手段〗
CAI教学、讨论教学、对比教学。
〖教学策略和程序〗
1.教师课前准备
图片资料,科学文摘,多媒体课件。
2.学生课前准备
上网、阅览室查找资料;复习细胞工程的相关知识。
3.教学过程(见表1)
4.作业设计
(1)完成《世纪金榜》基础梳理部分,巩固课堂上所学的知识。
(2)任何新技术的诞生,总会让人们争论不休,支持者当然可以举出无数理由,反对者也能历数此项技术的种种不足,对于“克隆动物”,你是持支持还是反对态度,并分别举出你支持或反对的理由。
〖教学反思〗
1.充分体现了新课程理念
本专题内容与学生生活联系的比较少,学生对此比较陌生,因此采用了学生先复习,教师运用多媒体演示和学生活动相结合的手段,在教学过程中,合理利用图表、流程图等,培养学生的观察能力、思维能力以及整合、运用科学信息的能力。充分调动了学生学习的积极性,激发了学生学习的兴趣和求知欲,培养了学生分析问题、解决问题的能力,进一步体现了学生学习的“主体”地位和教师的引导作用。
2.教学中存在的问题
(1)对课堂的调动不够,基础好的同学思维活跃,而基础差的同学在合作学习中参与的较少。
生物材料在组织工程中占据非常重要的地位，同时组织工程也为生物材料提出问题和指明发展方向。由于传统的人工器官（如人工肾、肝）不具备生物功能（代谢、合成），只能作为辅助治疗装置使用，研究具有生物功能的组织工程人工器官已在全世界引起广泛重视。构建组织工程人工器官需要三个要素，即“种子”细胞、支架材料、细胞生长因子。最近，由于干细胞具有分化能力强的特点，将其用作“种子”细胞进行构建人工器官成为热点。组织工程学已经在人工皮肤、人工软骨、人工神经、人工肝等方面取得了一些突破性成果，展现出美好的应用前景。
专家预计，新型组织工程的开发具有广阔的市场前景。目前，发达国家都投入巨资开展组织工程产品的研发。我国“十五”、“十一五”规划也将组织工程列入重点发展的领域之一，是“973”、“863”计划等资助的重要方向。福建是海洋大省，贝壳类海产品极为丰富，支架材料的来源非常广泛，且成本比现有的合成材料低三分之二，发展这一项目具有得天独厚的条件。
替代输尿管缺损的组织工程学材料
简介：随着组织工程学技术的发展,组织工程学材料之一--ECM作为修复缺损区的材料得到了广泛应用。该材料具备二个特点:(1)作为异体组织材料,在经特殊脱细胞处理后,已无含细胞抗原的细胞成分,仅保留了由胶原蛋白,蛋白多糖,糖蛋白等低抗原物质构成的ECM。ECM的种属差异小,抗原性弱,移植后不易产生排斥反应。(2)该材料可为细胞提供生存的三维空间,有利于细胞获得足够的营养物质,进行气体交换并排除废物。将输尿管ECM移植于缺损区后,保持输尿管完整性,保证尿液流通的作用,同时还可作为自体输尿管细胞生长框架,诱导自体细胞长入其内。因输尿管有极强的再生能力,移植后自体输尿管将形成新的具有原来功能和形态的输尿管,达到修复和重建的目的。
意义：为寻求理想的输尿管替代材料，该项目应用组织工程学材料--同种异体脱细胞输尿管细胞外基质作为输尿管替代材料,并在动物实验取得满意结果的基础上,成功应用于临床。
项目负责：北京积水医院泌尿外科；申鹏飞
湖南医科大学湘雅医院泌尿外科；胡杰
杰雅莱福生物技术公司技术部。
组织工程角膜生物材料载体制备
简介：成年York猪角膜基质材料，以Triton联合0.25%胰酶，处理30min～3h为材料1；Triton联合DNA、RNA酶，处理8～14h为材料2；Triton联合0.25%胰酶、DNA-RNA酶，处理3～5h为材料3。3种材料用无水氯化钙脱水干燥保存。在材料上接种兔角膜基质成纤维细胞，观察细胞生长情况。
结果：材料1、2细胞脱出不完全，处理最佳时间分别是2h和10～12h，角膜基质网状间隙无明显增大；接种兔角膜基质成纤维细胞后，3～4d细胞死亡；植入兔角膜基质中有明显的免疫排斥反应。材料3脱出细胞完全，其脱细胞处理的最佳时间为4h，角膜基质纤维结构无破坏，呈三维网状结构，网状间隙明显增大；接种兔角膜基质成纤维细胞后，细胞在材料上贴附生长良好；将其植入兔角膜基质中无炎性及排斥反应，可逐渐降解吸收，有良好的生物相容性。
意义：比较用不同的方法脱细胞处理异种（猪）角膜基质制备组织工程角膜支架材料，并对其生物相容性进行研究。试验证明：Triton联合0.25%胰酶、DNA、RNA酶法处理的异种（猪）角膜基质具有良好的生物相容性,可作为一种组织工程角膜的支架材料。
项目单位：武警陕西总队医院
第四军医大学口腔医学院组织病理学教研室组织工程实验中心
第四军医大学西京医院。
应用于心肌组织工程的支架材料
简介：本发明属于组织工程领域，具体涉及一种应用于心肌组织工程的支架材料的制造方法。该支架在组成上尽量模拟心肌细胞的细胞外基质成分。它的原始形态为一种液态水凝胶，主要由液态胶原(I型和III型等)、弹性蛋白、层粘连蛋白、鸡胚抽提物、2×DMEM和胎牛血清等组成。将这些成分按适当的比例混合即可形成类似于天然心肌组成的支架材料，与心肌细胞混合后可铸成各种形状心肌细胞-支架材料构建物。用这种支架材料可构建出一致跳动的组织工程化心肌组织。
意义：一种应用于心肌组织工程的支架材料的制造方法。根据天然心肌细胞外基质的主要组成分按适当的比例和步骤混合而成，具有促进心肌细胞生长和跳动的生物学特性和力学性能。
项目负责：中国人民军事医学科学院基础医学研究所。
可降解聚合物用作骨组织工程细胞外基质材料
简介：现有的骨替代材料用作骨组织工程细胞外基质材料都或多或少的存在一些缺点。人工合成可降解聚合物材料由于其组成成分、分子量、表面微结构、大体形态、机械性能、降解时间等都能预先设计和调控，最后基本降解完全，避免了长期异物反应的危险，但是相比天然生物材料，人工合成材料最大的缺点是缺乏细胞识别信号，不利于细胞特异性粘附及特异基因的激活。为了增强材料对成骨细胞的粘附力，采取吸附或溶剂链接的方法，将纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、胶原或某些促细胞粘附氨基酸短肽如精氨酸-甘氨酸一天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)短肽和天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸(Asp-Gly-Glu-Ala，DGEA)短肽引入基质材料的表面或整体，必将促进细胞粘附，增强生长代谢。
意义：该项目进一步相信随着材料科学及其制作加工工艺的不断发展，以及对材料-细胞相互作用研究的不断深入，以合成可降解聚合物为主要成分的有利于成骨细胞粘附和分化的新型基质材料在骨组织工程研究领域必将展现喜人的应用前景。
骨组织工程多孔支架材料
简介：本项目研究包括钙磷生物陶瓷粉末的合成，可降解聚合物聚乳酸的合成，以及生物陶瓷、聚乳酸及天然聚合物材料多孔体的制备，应用多孔支架对兔胫骨骨缺损进行修复的研究。
1）对钙磷生物陶瓷粉末的合成工艺过程进行了改进，应用Ca(OH)2与H3PO4中和反应，成功制备了β-TCP和HA粉末，具有工艺简单、合成量大的优点。
2）以Al、Mg酸式磷酸盐为粘结剂，钙磷陶瓷粉体为原料，采用有机泡沫浸渍工艺制备了骨组织工程多孔支架。通过对原料和成形过程的控制，可以改变支架中磷酸盐组成，调控支架的降解速度。
3）以冰微粒为致孔剂，开发了制备块状聚合物多孔支架的冷冻干燥―粒子滤出复合方法，用此方法制备的聚乳酸块状多孔支架无致孔剂残留，可解决目前国际上大孔、块状聚合物多孔支架成形的工艺难题。
4）将种子细胞种植于多孔支架上进行培养，构成种子细胞―支架复合体，研究了支架的细胞相容性。并制备了动物骨缺损模型，将种子细胞―支架复合体植入，修复骨缺损，初步结果满意。
5）掌握了纳米抗菌材料粒子单分散工艺，在天然聚合物多孔膜片上复合纳米抗菌材料，制备了多孔生物材料复合膜片，可作为新型密闭性伤口敷料用于伤口治疗。
意义：合成的生物陶瓷和聚乳酸材料在生物材料领域具有广泛的用途，研制的多孔体可应用于骨、软骨组织工程及用作药物缓释载体。
项目单位：东南大学。
骨髓间充质干细胞生物特性及其构造组织工程软骨
简介：软骨构建及软骨缺损的修复组织工程学是20世纪80年代末发展起来的一门新兴边缘学科。MSCs在适宜的体内或体外环境下，不仅可分化为间充质组织，还可以保持内外胚层的组织发育分化潜能，可以分化成神经系统、肝、肺、上皮组织等。干细胞中的MSCs固有的优势和特性将在软骨组织修复中成为首选种子细胞,可通过取自体且体外扩增的MSC回植自体内修复重建软骨组织缺损。多项实验表明在地塞米松的作用下，MSCs可以向骨、软骨、脂肪甚至肌细胞等方向分化。在体外培养的骨膜细胞中加入TGF-β1后，可诱导其分化为软骨细胞。TGF-β1在MSCs定向分化为软骨细胞的过程中起到了非常关键的作用。TGF-β1能诱导MSCs转化为软骨细胞，同时对软骨细胞的分化和功能具有双向调节作用，促进未分化或分化早期软骨细胞DNA合成、增殖、分化及细胞外基质的合成，抑制成熟软骨细胞的增殖和分化。TGF-β1在MSCs生成软骨诱导分化中发挥重要作用，其作用机制目前尚不清楚。
意义：作为细胞移植的细胞源，MSCs具有独特的优越性：①骨髓组织取材容易，可以通过穿刺获得。②骨髓干细胞分离扩增方法简单，成人的MSCs仍保持了多方向分化的潜能。③可以用于自体移植，避免的排斥反应和疾病传播。④人骨髓干细胞移植的方法已经经过临床验证。随着MSCs及其在软骨组织工程中研究的不断深入，相信组织工程软骨将成为软骨缺损修复的最有效方法。
项目负责：河北省唐山市华北煤炭医学院附属医院；
软骨组织工程用生物降解型可注射的改性水凝胶支架
简介：将水溶性氧化、还原引发体系、去离子水、二种生物相容性聚合物的单体按重量比相混合配制成均匀溶液，在恒温水浴中反应，则可得到可用于软骨组织工程的可注射性水凝胶。1.一种软骨组织工程用生物降解型可注射的改性水凝胶支架，其特征在于：将水溶性氧化还原引发体系、去离子水、二种生物相容性聚合物的单体按重量比相混合；其氧化剂∶还原剂∶去离子水∶聚合物单体1∶聚合物单体2为1～120mg∶1～70mg∶1～30g∶1g∶0.1～30g配制成均匀溶液，在20℃-50℃恒温水浴中反应1min-60min，则可得到未混悬软骨细胞的凝胶。
【关键词】多西苯醌;塞来昔布;联合抑制;结肠癌HT29细胞;VEGF
ResearchofDocebenonecombinedCelecoxibInhibitHumancoloncarcinomacellline
LIUChunying,LIJinfeng,LIMingqiang,etal.DepartmentofGastroenterology,AffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian11600l,China
【Abstract】ObjectiveTocomparativeinvestigatetheinfluenceofAA861aloneorincombinationwithCelecoxibontheproliferationofcoloncarcinomaHT29cellline.MethodsGroupculturedcoloncancerHT29cells,ThemorphologicalchangesofHT29cellswasobservedbyinvertedphasecontrastmicroscopeafterDocebenone(AA861)andCelecoxibaloneorincombination;Bycellproliferationassay(MTT)detectcellabsorbancesoastotestcellproliferation;TheexpressionchangeofVEGFwasdetectedbyImmunofluorescencestainingexperimentsunderConfocalmicroscope.ResultsWecanobservethatcellmorphologychanedsignificantlyundertheinvertedphasecontrastmicroscope,andthegroupofAA861andCelecoxibincombinationchangedmostobvious;TheseresultsofMTTsuggestthatthegroupoftwodrugsincombinationshowsthelowestrateofcellproliferation.ImmunofluorescencestainingexperimentsrevealedthattheexpressionofVEGFwasdecreased,andthegroupoftwodrugsincombinationhasthelowestexpression.ConclusionAA861andCelecoxibincombinationcanproduceasuperioranticoloncancereffectionthanAA861orCelecoxibalone,andthiseffectmayberelatedwithinhibittheexpressionofVEGF.
【Keywords】Docebenone;Celecoxib;Associativeinhibition;ColoncarcinomaHT29cellline;VEGF
近年来研究发现结肠癌组织中存在环氧化酶2(COX2)及5脂氧合酶(5LOX)的高表达,而相应的正常组织或癌旁组织中则不表达或表达量很极少。应用选择性COX2抑制剂或5LOX抑制剂都能抑制结肠癌细胞增殖,但是对于联合应用COX2及5LOX抑制剂对结肠癌的抑制作用报道很少。我们通过体外细胞实验比较单独及联合应用COX2抑制剂塞来昔布及5LOX抑制剂AA861对结肠癌的抑制作用。以期二者小剂量联合应用,在减轻副作用的前提下协同获得最大的抗癌效果。
1材料和方法
1.1材料人结肠癌HT29细胞(由大连理工大学生物医学工程实验室惠赠);胎牛血清、1640培养基分别购自Hyclone公司、胰蛋白酶购自Gibico公司;塞来昔布与AA861均购自美国Sigma试剂公司;鼠抗人VEGF抗体购自Santacruz公司,FITC标记山羊抗小鼠IgG购自北京中衫金桥生物公司。其余试剂均为国产生化试剂。
1.2方法
1.2.1细胞培养及分组人结肠癌HT29细胞采用含10%胎牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的PRMI1640培养液,置于37℃5%的CO2培养箱中传代培养。按实验设计分为对照组、AA861组(50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)、塞来昔布组(50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)、AA861联合塞来昔布组(50μmol/LAA861+50μmol/L塞来昔布组、100μmol/LAA861+100μmol/L塞来昔布)。
1.2.2倒置相差显微镜观察细胞生长形态变化取生长对数期细胞,经胰酶消化后,以3×104~5×104/孔接种于六孔板中,待细胞贴壁生长稳定后,弃去孔板中原培养液,分别按上述分组,加入含有药物的培养液作用48h后,在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。
1.2.3MTT细胞增殖试验取生长状态良好的对数生长期细胞,按1×105/ml的密度接种于接种于96孔板中,每孔加入100μl,每列的第一孔不加细胞,为空白对照调零,于培养箱内培养。细胞同步化后,分为空白对照组、塞来昔布组、AA861组、塞来昔布组联合AA861组,具体浓度如前所述,药物作用第1、2、3天分别每孔加入0.5%MTT液20μl,继续培养4h后吸出孔内液体,每孔加入DMSO200μl,立即置入酶标仪中震荡后于492nm处波长下测定各孔吸光度(A492),细胞抑制率计算公式为:细胞抑制率=(1实验组A492/对照组A492)×100%。
1.2.4免疫荧光染色方法观察VEGF蛋白表达情况具体实验方法为:取生长对数期细胞,经胰酶消化制成单细胞悬液后,细胞爬片;待细胞生长稳定后,按上述实验分组药物作用48h后PBS充分漂洗,分别通过4%多聚甲醛固定、0.2%Triton细胞穿孔、1%BSA封闭;然后避光加入1%BSA稀释的一抗4℃孵育过夜;PBS漂洗后避光加入1%BSA稀释的二抗于37℃杂交1h;最后用PBS洗掉杂质,封片,在激光共聚焦显微镜下观察、拍照,利用ImageProPlus6.0软件分析细胞内荧光强度,以细胞内的平均荧光强度反映细胞内VEGF的表达量。
1.2.6统计学分析所得实验数据以(x±s)表示,采用SPSS13.0forwindows软件包进行分析。
2结果
2.1药物处理后结肠癌HT29细胞形态学变化倒置相差显微镜观察到对照组正常生长的结肠癌HT29细胞,呈类圆形,少数呈梭形,且细胞折光性好,以贴壁方式生长,经过药物作用24h后,50μmol/LAA861与50μmol/L塞来昔布组细胞分别表现出现细胞变圆变小,细胞内颗粒状物质增多,折光性降低,这种变化随着时间及药物浓度的加大,更加明显,尤其AA861与塞来昔布联合作用72h后,细胞生长状态最差,部分细胞呈悬浮状态生长(图1)。
2.2AA861与塞来昔布单独及联合应用对HT29细胞增殖的抑制AA861与塞来昔布单独及联合作用于HT29细胞后,都以时间浓度依赖性抑制细胞增殖,其中AA861100μmol/L(43.2%),塞来昔布100μmol/L(42.8%),100μmol/Lmol/LAA861+100μmol/L塞来昔布组(53.8%),两种药物联合应用组抑制率分别高于单独应用AA861(P
表1
AA861与塞来昔布单独及联合应用48h后
HT29细胞的吸光度(x±s)
药物组吸光度
对照组0.528+0.005
AA861100μmol/L0.300+0.003*#
塞来昔布100μmol/L0.302+0.002*#
AA861100μmol/L+塞来昔布100μmol/L0.244+0.005*
注:*P
2.3激光共聚焦显微镜检测细胞内VEGF表达以细胞内平均荧光强度表示细胞内的VEGF表达情况,免疫荧光照片显示,各实验组细胞免疫荧光强度随着药物浓度的加大逐渐减弱,而两种药物联合应用组荧光强度最弱(图2)。经图像分析软件分析后,各实验组与对照组细胞的荧光强度有统计学意义(表2)。
表2
AA861与塞来昔布单独及联合应用48h后
HT29细胞VEGF表达的影响(x±s)
分组细胞平均荧光强度
对照组0.046+0.002
AA861100μmol/L0.025+0.001*#
塞来昔布100μmol/L0.027+0.002*#
AA861100μmol/L+塞来昔布100μmol/L0.017+0.002*
注:*P
图1AA861与塞来昔布单独及联合应用48h后HT29细胞形态学变化(10×)
A:对照组;B:塞来昔布100μmol/L;C:AA861100mol/L;D:100μmol/LAA861+100μmol/L塞来昔布
图2AA861与塞来昔布单独及联合应用48h后HT29细胞内VEGF表达情况
A:对照组;B:塞来昔布100μmol/L;C:AA861100mol/L;D:100μmol/LAA86+100μmol/L塞来昔布
3讨论
花生四烯酸(arachidonicacid,AA)是人体必需的一种不饱和脂肪酸,广泛存在于哺乳动物的中性脂肪中,参与组成细胞膜磷脂,在磷脂酶A2和磷脂酶C的作用下可分解生成游离的花生四烯酸。AA代谢主要有环氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)两条代谢通路,COX2及5LOX分别通过各自的代谢产物前列腺素
(PGs)和白三烯(LTs)等参与肿瘤的发生发展过程[12]。随着研究的深入,发现AA的代谢通路COX2及5LOX之间存在交叉平衡关系,GouletJL等[3]的实验发现,敲除5LOX、COX1、COX2等基因可以引其他花生四烯酸代谢途径的活化,并且,应用其中一条通路的化学抑制剂后也可以活化另外的代谢途径[4]。FabioCianchi[5]等的实验发现,结肠癌的Caco2和HT29细胞都有COX2和5LOX的高表达,并且两种细胞应用COX2抑制剂塞莱昔布后都出现了COX2代谢产物PGE2的降低,然而也都出现了5LOX代谢产物CysLT的升高。而联合应用塞莱昔布和MK886后,则可以抑制塞莱昔布引起的CysLT上升和MK886引起的PGE2上升,并且对肿瘤的抑制效果优于只用一种同浓度抑制剂的实验组。本实验中采用5LOX抑制剂(AA861)和COX2抑制剂(塞来昔布)分别单独及联合应用,通过相差显微镜观察到,两种药物都能使体外培养的结肠癌HT29细胞的形态发生明显变化,而两种药物联合应用组,细胞形态变化最明显,细胞增殖受到明显抑制。MTT结果提示AA861与塞来昔布都以时间浓度依赖性抑制结肠癌细胞增殖,且两种药物联合应用组抑制率最高。这可能是因为同时抑制花生四烯酸的两条代谢通路后,阻止了一条代谢通路向另一条代谢通路的分流作用,从而产生更强的抗肿瘤作用。
血管内皮生长因子(VEGF)及其受体的过度表达与肿瘤生长、侵袭及转移关系密切,以VEGF及其受体作为相对特异的肿瘤血管生成标记物,抑制其表达或阻断其效应是目前国内外抗血管生成治疗肿瘤的热点。研究资料发现,COX2可以促进结肠癌细胞诱生血管生长因子,Tsujii等[6]对转染COX2基因的结肠癌细胞株CaCo2进行研究发现,CaCo2在过度表达COX2的同时,促血管生成因子VEGF、TGFβ、bFGF等均明显上调,从而提供了COX2参与肿瘤新生血管生成的有力证据。夏光涛等[7]发现应用5LOX抑制剂作用于结肠癌HT29细胞后,肿瘤细胞转移能力下降,并且与VEGF表达受抑制有关。本实验利用COX2抑制剂塞来昔布与5LOX抑制剂AA861联合应用后,通过细胞免疫荧光染色可以看到细胞内VEGF的表达比对照组明显减弱,而两种药物联合应用后,细胞荧光强度最弱,提示联合应用组细胞内VEGF表达量最低。
有研究证实选择性COX抑制剂塞来昔布对结肠癌细胞剂量依赖性的抑制作用是非常有限的,超大剂量的药物不良反应也是无法避免的。晚近研究发现:5LOX的抑制剂AA861对肿瘤生长抑制作用比COX抑制剂强,且未发现明显副作用。从多环节发挥抗癌作用的角度考虑,结肠癌的药物治疗应采用多种药物的联合治疗,这样可为在机体耐受每一种药物的不良反应范围内及不增量的前提下,产生最大的抑制肿瘤效应。而5LOX抑制剂与COX2抑制剂联合应用后对结肠癌细胞的抑制作用可能与对细胞内VEGF的抑制作用有关,也可能与两者联合应用后通过减少下游产物,作用于一系列信号通路及凋亡相关蛋白,促进细胞凋亡,并阻断底物转移所致的另一代谢通路激活,进一步阻断5LOX或COX2的促癌作用有关。其确切机制仍需要我们进一步的探讨。
参考文献
[1]SinicropeFA,GillS.Roleofcyclooxygenase2incolorectalcancer.CancerMetastasisRev,2004,23:6375.
[2]HoqueA,LippmanSM,WuTT,etal.Increased5lipoxygenaseexpressionandinductionofapoptosisbyitsinhibitorsinesophagealcancer:apotentialtargetforprevention,Carcinogenesis,2005,26(4):785791.
[3]GouletJL,SnouwaertJN,LatourAM,etal,Alteredinflammatoryresponsesinleukotrienedeficientmice.ProcNatlAcadSciUSA,1994,91:1285212856.
[4]FiorucciS,MeliR,BucciM,etal.Dualinhibitorsofcyclooxygenaseand5lipoxygenase.Anewavenueinantiinflammatorytherapy.BiochemPharmacol,2001,62:14331448.
[5]FabioCianchi,CamilloCortesini,LuciaMagnelli,etal.Inhibitionof5lipoxygenasebyMK886augmentstheantitumoractivityofcelecoxibinhumancoloncancercells.MolCancerTher,2006,5(11):27162726.
创伤和失血后,心输出量和器官血流量出现变化,使组织灌注和氧供降低,导致细胞缺氧和器官损伤,甚至死亡。血管内皮细胞释放NO,是控制血管平滑肌张力的关键因素。创伤和失血后血管内皮功能受到抑制,内皮源性NO释放减少,使血管舒张功能减退甚至消失,血小板聚集增加和中性粒细胞侵入增加;毛细血管也出现这些反应,微血管的通透性增大,内皮的完整性受到破坏,出现毛细血管渗漏,粘附分子如细胞间粘附分子(ICAM)-1、血管细胞粘附分子(VCAM)-1、P选择素和E选择素等的表达增高,从而启动炎性反应,进而导致创伤-出血性休克后的免疫抑制。已经证实外源性性抗原由巨噬细胞胞吞和溶胞为小的抗原多肽之后,这些小的抗压多肽由其细胞表面的MHC-II分子递呈给CD4+T细胞,抗原提呈需要细胞表面受体如CD4、细胞表面结合和可溶性的分子激活T细胞,其中IL-12和TNF-α决定是否产生Th1依赖的细胞免疫和巨噬细胞激活,IL-4和-10决定着是否产生Th2依赖性的免疫抑制。
2.手术后巨噬细胞功能
2.1巨噬细胞的细胞因子释放
多数手术后免疫研究通过外周血细胞功能和血浆各种相关介质的水平进行评估。很多动物实验和临床研究检测大手术后各种炎症介质的释放、激活或抑制及其进展和相互作用。手术或创伤后患者易出现免疫防御功能受损。动物实验发现,失血性休克后的细胞免疫功能很快出现抑制;创伤-失血休克后,脾、腹膜和肺泡的巨噬细胞对脂多糖刺激而释放白介素(IL)-2、-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α的能力降低;脾和腹膜巨噬细胞IL-6释放抑制一直持续达7天之久;相对于软组织损伤合并失血性休克,软组织损伤合并失血性休克和骨折时免疫抑制时间更久。临床发现,手术创伤后循环中的单核细胞对细菌或内毒素的反应能力降低;并发脓毒血症患者术后很快就出现单核细胞失功能,其促炎和抗炎因子分泌均显着降低,这提示免疫抑制是手术的一个直接反应,而不是机体对手术的间接调节反应。脓毒血症的转归与单核细胞促炎因子功能的恢复相关,而与抗炎因子无关。
单核细胞源性细胞因子IL-12可启动充分的T细胞反应,手术前选择性抑制单核细胞IL-12的分泌,手术后就会出现致命性的脓毒血症;大创伤早期就出现单核细胞IL-12的量和活性均下降,单核吞噬细胞系统的IL-12分泌抑制使创伤早期的T细胞反应表现为Th2方式。
创伤-失血休克后,与脾、腹膜和肺泡巨噬细胞不同,休克后24内库否氏细胞表现为分泌促炎因子(IL-2、-6和TNF-α)的能力增强,失血性休克和复苏后2小时库否氏细胞TNF-α增高,而脾巨噬细胞分泌下降。Pellegrini等证实创伤病人的细胞相关TNF-α与可溶性TNF-α受体的比值变化和多脏器功能衰竭的发生率呈正比,细胞相关TNF-α的变化在损伤后免疫调节中起着重要作用。由于库否氏细胞、脾和腹膜的巨噬细胞所处的微环境不同,上述资料还说明创伤和失血性休克在不同的组织床产生的效应不同,可能由于脾中的巨噬细胞与T细胞最接近,而在创伤-失血性休克后的免疫抑制中发挥更重要的作用。虽然不同微环境中巨噬细胞所分泌细胞因子的变化有所不同,但是创伤-失血性休克后所有组织床中巨噬
细胞的抗原提呈功能均表现为抑制。
2.2大手术后巨噬细胞的抗原提呈
抗原提呈是抗原提呈细胞在其表面表达抗原,并可以被T细胞识别。抗原一般先处理为小的抗原肽,然后和MHC-II形成复合体并递呈给帮助T淋巴细胞,或者和MHC-II形成复合体而成为细胞毒性T淋巴细胞的目标,一个完整的抗原提呈过程还要求抗原提呈细胞提供一个膜和/或可溶性的共刺激信号。手术患者并发脓毒血症的关键因素是单核细胞功能受损和单核细胞-T细胞相互作用受到抑制,人白细胞抗原(HLA)-DR受体表达被抑制并发脓毒血症的几率增大,且抑制程度与预后正相关;如果早期矫正HLA-DR受体表达的抑制,则脓毒血症的发生率降低;一旦创伤病人的延迟型超敏反应(亦为抗原特异性)被抑制,则预后很差。大手术后FcR+单核细胞亚群比例增高,该亚群与激活的巨噬细胞变化相似,均表现为促炎因子合成增加和抗原提呈抑制。
创伤和大型手术后患者细胞免疫发生抑制,使脓毒血症发生率增高,部分原因可能是巨噬细胞的抗原提呈能力下降。已经发现多个因素,包括代谢率、抗炎因子、前列腺素类和NO等降低,与巨噬细胞抗原提呈能力下降有关,T细胞反应受损是否是巨噬细胞功能降低的原因仍有争论。
3.失血性休克后淋巴细胞功能
临床和基础研究均发现,手术、钝性伤和切割等创伤后T细胞对刀豆素A和植物凝血素等促有丝分裂刺激的反应能力降低,且降低程度与损伤程度成正比;创伤-失血性休克后脾细胞对丝裂素和刀豆素A等刺激的增殖能力降低;Hensler等发现大手术后T淋巴细胞体外增殖和细胞因子分泌功能严重受损。这些研究均观察到手术后早期T淋巴细胞分泌功能受损,其IL-12、INF-γ和TNF-α分泌下降。T细胞增殖和分泌IL-12和TNF的能力受损与脓毒血症死亡率成正比,提示T细胞在手术后感染的免疫防御中的重要作用。
创伤-失血性休克2小时后脾细胞所分泌的Th1淋巴因子如IL-12和INF-γ等降低,这一抑制一直持续达5天之久,而抗炎因子IL-10(Th2淋巴因子)则增高。在创伤动物的脾细胞培养皿中加入抗IL-10单克隆抗体以中和IL-10,可以恢复脾细胞被抑制的增殖能力。烧伤后早期应用抗IL-10治疗可防止T细胞免疫抑制和提高脓毒血症的生存率。因此,创伤-失血性休克后IL-10分泌增加可能是导致脾细胞Th1淋巴因子受到抑制的重要原因。
4.循环炎性和抗炎介质
部分在创伤和大手术后出现免疫抑制的患者,可以出现血浆炎性细胞因子浓度增高,说明这些病人的免疫潜能细胞被激活,而上文的离体研究所发现的细胞免疫抑制现象,可能是体内发生了大的免疫激活后的免疫细胞低反应性表现。
动物和人体研究均发现,创伤、严重失血和脓毒血症时血浆中促炎因子,如TNF-α、IL-1和IL-6等,增大幅度增高。IL-6同时还有抗炎效应:在控制局部和全身的急性炎症反应中起着关键作用,可以刺激一些抗炎因子,如IL-1受体拮抗剂和TNF受体等,的释放,IL-1受体拮抗剂和TNF受体与循环中促炎因子结合而发挥抗炎作用。IL-6还能触发前列腺素E2(PGE2)的释放,后者可能是最强的内皮源性T细胞和巨噬细胞免疫反应抑制剂,PGE2可以引起强抗炎因子IL-10的释放,进而抑制单核细胞活性。使用IL-10抗体可以恢复PGE2引起的单核细胞抑制。这种血浆因子变化临床上称为抗炎反应综合症。目前对手术和脓毒血症患者进行的一些细胞因子治疗,可能是由于用药时间、剂量或合用药物等因素难以掌握,没能取得满意的临床效果。
上述研究提示了促炎因子在手术或创伤病人病理生理中的重要地位,临床上的重症监护病人进行这些促炎因子和抗炎因子的监测,可以提示细胞内所发生的一些变化和细胞内环境,这对于危重病治疗可能很有用处。
5.性别对免疫反应的影响
很多的研究显示创伤出血性后的免疫抑制具有性别特异性:雌鼠周期的前期进行创伤-失血性休克,其巨噬细胞和淋巴细胞反应性能够正常维持,甚至得到加强,而雄性鼠则表现为抑制;雌鼠创伤-失血性休克时,信号传导通路p38呈现减弱状态,而雄性鼠的该信号通路传导增强,这一差别可能是前者在诱导脓毒血症后病死率低的主要原因。免疫抑制的性别特异性说明雄性激素具有免疫抑制作用,而雌性激素具有免疫保护作用,雄性鼠去势两周后再进行创伤-失血性休克时,脾和腹膜巨噬细胞因子的释放和皮细胞免疫反应就得到了保护,巨噬细胞MHC-II表达的抑制现象也不见了。雌激素具有免疫增强作用,给雄性鼠注射雌二醇可以使创伤失血性休克后的免疫抑制得到恢复;卵巢切除的雌性鼠表现免疫抑制,再进行中枢性雌激素支持又可以维持其免疫反应。临床上脓毒血症、大手术、创伤或大失血的患者可以见到同样的免疫抑制性别特异性现象,感染的发病率和死亡率男性均高于女性
6.可能的免疫调节对策
应激后宿主的免疫反应加剧是双刃剑,目前的免疫治疗目标是既保护其防御机制又可以抑制其副作用,一般采用免疫调节的方法,而不是阻滞某个介质。
免疫调节的原理多是基于性激素/受体拮抗剂对T细胞和单核细胞的免疫调节特性。创伤-出血性休克和复苏后应用雄激素受体拮抗剂氟他胺,可以使脾和腹膜巨噬细胞受到抑制的细胞因子释放得到恢复正常,在并发脓毒血症之后连续3天应用氟他胺亦有相似的促恢复效果,并可降低大出血后由脓毒血症所致的死亡率。临床上氟他胺用药时间远超于3天都少见副作用,用于创伤病人进行免疫抑制的调节会一个是很好的选择。女性激素本身就有保护创伤-休克后免疫反应的作用,研究发现对哪行和卵巢切除患者应用单次剂量的雌二醇可使受到抑制的免疫功能恢复。雌二醇可能就是女性维持免疫反应性的原因,应用于男性、卵巢切除或停经女性可恢复创伤和大失血后的免疫抑制。
脱氢表雄酮是血浆中含量最多的类固醇激素,它是合成5α-双氢睾酮和雌二醇的中间产物,可使雄性鼠创伤-失血性休克后的T细胞和单核细胞抑制得到恢复,显着改善并发脓毒血症者的生存率。体外脱氢表雄酮增强脂多糖对大手术后患者外周血单个核细胞(PBMCs)细胞因子释放的抑制作用,对手术后血浆培养的手术后细胞亦具有显着的免疫调节作用;体外雌二醇受体阻滞剂三苯氧胺可以阻断脱氢表雄酮对T细胞和PBMCs的免疫保护作用,提示脱氢表雄酮免疫保护机制与雌二醇受体有关。已经证实短期使用脱氢表雄酮没有明显的副作用。因此,脱氢表雄酮可用于治疗免疫抑制,但是手术患者中脱氢表雄酮的在体效果还有待证实。
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)也具有免疫调节作用,它可诱导手术后释放新的单核细胞。研究显示围手术期应用G-CSF可防止手术后单核细胞活性降低、保持适当的Th1/Th2比值和适当减轻免疫细胞的急性期反应程度,还能够减少手术后并发脓毒血症的发病率。免疫增强膳食和高张盐水复苏亦可降低手术后的脓毒血症的发生率,据推测可能是这些方法有助于维持平衡的免疫细胞和炎症介质。
上述药物在手术后患者中预防脓毒血症和提高生存率的效果还有待于大型的临床研究证实。