细胞生物学是生命科学中的前沿和枢纽学科，生命科学的各个分支学科在细胞层次上进行交汇。细胞生物学同时作为一门重要的基础学科，是本科院校生命科学、医学、农业等专业的重要专业核心主干课程。近年来细胞生物学新的知识内容和研究方法层出不穷，发展迅猛。要使教学内容紧跟细胞生物学发展的前沿；要使学生能了解细胞生物学最新研究成果，培养学生自主获取新知识的能力；传统的教师为主体的课堂教学模式已无法满足要求[1]。在有限的课内教学学时内提高课程教学效果，必须对现有的教学手段和教学方法进行改进，摸索出一种新的课堂教学模式。
传统的教师为主体的教学忽视了学生自主学习、自主探究能力的培养，抑制了学生的研究兴趣与创造性，与对创新人才的强烈需求形成尖锐矛盾[2]。细胞生物学教学根据课程的特点和培养目标，构建课内互动教学结合课外自主学习的“研究型”课堂课教学模式。在研究型教学中，学生是教学过程的主体，学生要在研究中学习和成长，培养学习的主动性和独立性；教师在整个教学过程中起组织者、指导者、帮助者和促进者的作用。课内教学中教师发挥主导作用：对细胞生物学中的经典部分进行讲解；突出学生主体地位：通过案例、专题知识等环节采用启发引导、讨论互动的教学方式，通过科学研究式的学习激发学生学习兴趣，提高教学效果，使学生掌握细胞生物学中的前沿部分。因细胞生物学课内教学学时有限，研究型课堂教学强调课外学生的自主学习。课外自主学习通过教师每次课后推荐的相关文献、视频等资料进行拓展学习，同时结合文献阅读撰写小论文和自主学习小组研讨活动开展，课外学习效果纳入过程性考核成绩。
细胞生物学研究型课堂教学模式从杭州师范大学生命与环境科学学院生物技术专业2009级学生开始，连续实施了四届。为了解学生对细胞生物学研究型课堂教学模式实施的意见和效果评价，以期在今后的实施过程中进一步完善，对2016年6月授课结束的2013级生物科学（非师范）专业学生进行了课程的问卷调查。
一、调查对象与方法
（一）调查对象
杭州师范大学2016年完成学习细胞生物学课程的2013级生物科学（非师范）专业的学生。
（二）调查方法[3-4]
采用问卷调查的方法，共发放调查问卷36份，收回有效问卷34份，有效回收率为94.44%。调查问卷由学生独立填写，当场回收。
二、调查内容
调查内容主要涉及：研究型课堂教学模式对细胞生物学课程内容学习的影响；对本专业学习的影响；对学生综合能力的影响；学生对研究型教学模式适应性评价；学生对研究型教学模式课堂效果的评价和建议。
三、调查结果分析
（一）研究型课堂教学模式对课程内容学习的影响
研究型课堂教学模式对课程内容学习的影响见表1，在被调查的34名学生中，选择研究型课堂教学模式能促进理解掌握每次细胞生物学课堂教学内容的学生为32人，占调查对象的94.12%；31名，占调查对象91.18%的学生认为新的教学模式能更系统地掌握细胞生物学整门课程的知识；85.29%的学生认为新教学模式能帮助了解细胞生物学课程的前沿内容。
（二）研究型课堂教学模式对本专业学习的影响
研究型课堂教学模式对本专业学习的影响见表2，在被调查的34名学生中，选择通过研究型课堂教学模式的学习获得的能力能帮助本专业其他课程学习的学生为25人，占调查对象的73.53%；79.41%的学生认为能激发其学习本专业的兴趣；91.18%的学生认为能拓宽本专业知识面。
（三）研究型课堂教学模式对学生综合能力的影响
研究型课堂教学模式对学生综合能力的影响见表3，在被调查的34名学生中，选择通过研究型课堂教学模式的学习提高了文献检索查阅能力的学生为29人，占调查对象的85.29%，其中20.59%的学生认为有明显提高；58.82%的学生认为能增加解决问题的能力；67.65%的学生认为能增强团队协作意识；64.71%的学生认为能增强与他人交流的能力。
（四）学生对研究型教学模式适应性的情况
学生对研究型教学模式适应性的情况见表4，在被调查的34名学生中，选择对授课教师满意34人，占调查对象的100%；61.76%的学生认为与传统的教学模式相比能适应研究型的教学模式；67.75%的学生课程考核方式合理；76.47%的学生认为新的教学模式占用的课余时间比较合理。
（五）学生对研究型教学模式课堂效果的评价
学生对研究型教学模式课堂效果的评价情况见表5，在被调查的34名学生中，23名学生更喜欢教师采用研究型教学模式进行授课，占调查对象的67.65%；82.35%的学生认为能够提升学习积极性；79.41%的学生认为课程的教学互动和课堂氛围好；91.18%的学生建议学弟学妹们继续采用研究型教学模式。
四、讨论
细胞生物学的发展迅猛，课程内容难以用教材来全部涵盖，也无法仅靠课内有限学时来更好地提高教学效果。因此必须发挥学生的自主性，引导其开展研究性的学习，以获取新的知识[5]。自推动《细胞生物学》课程新教学模式以来，受益学生的实践能力普遍有明显提升，受到实习学校和用人单位的一致好评。学生的科研创新能力明显提高，学生以第一作者发表科研论文4篇，获8项的科研立项，6项的科研竞赛获奖。
通过本次细胞生物学研究型课堂教学模式效果调查结果显示，通过研究型课堂教学，大多数的学生认为能帮助对细胞生物学课程系统性的学习，更好地能了解细胞生物学课程的前沿内容。同时通过新教学模式的学习能增强文献检索查阅能力、解决问题能力；通过新模式中的自主学习小组研讨活动增强了团队协作意识和交流能力。获得的能力能帮助专业其他课程的学习，从而激发学习本专业的兴趣，拓宽专业的知识面。大部分的学生认为能较好地适应新的教学模式。因为新的教学模式除了课内的学习还有较多的课外自主学习，大多数的学生认为占用的课余时间比较合理。91.18%的?W生建议继续推行研究型教学模式。
【关键词】细胞代谢代谢性疾病细胞代谢障碍
【中图分类号】G71【文献标识码】A【文章编号】2095-3089（2012）08-0204-01
要认识细胞和疾病的关系，首先要明确细胞是生命活动的基本单位。细胞作为功能与代谢的基本单位，其具有有秩序的、单独的通过自我控制的复杂代谢体系。在生物有机体进行的一切与生命活动相关的各项代谢活动与执行功能过程中，细胞就作为一个有秩序的、各个细胞独立的、自我控制能力很强的的代谢体系参与到有机体生命活动中。而细胞代谢又是细胞正常生长不可缺少的生命活动。因此细胞代谢与各种疾病的关系也是密不可分的。所以要想研究细胞和疾病的关系必须从细胞的生命活动当中去寻找，首先是细胞的新陈代谢，大约平均每过三个月人体细胞的结构就要更新一次，因而细胞能否正常代谢就决定了细胞更新后的结构是否完整。
疾病和细胞的关系还可以从细胞的结构上去研究，近年来的科学研究发现，人体内的细胞外基质的功能对生物学意义不仅表现在物理学性质和作用上，而且肿瘤的转移、人体的发育、细胞的损伤与修复、免疫应答以及在细胞的分化与移行信号的传导等生理过程和炎症等病理过程中具有重要的功能和作用，最近几年来，细胞外基质与各种临床疾病的关系已经成为各种生物学以及疾病研究的重点对象，细胞外基质的研究也作为细胞生物学与生物学研究的热点越来越受到人们的重视。
研究细胞代谢和疾病的关系也不能落下研究细胞的分化，细胞分化异常就会变成癌细胞，因此就会产生癌症这种骇人听闻的疾病，癌症相信大家都知道，我国每年死于癌症的就有200万人。最后，就像生物体一样，细胞也有衰老和死亡，因此细胞的衰老和死亡也是研究细胞代谢和疾病的关系的一个方面内容，细胞的衰老了就会使使细胞代谢活力下降，因此细胞的生存能力下降，很好理解，细胞生存能力下降，各种功能就不会满足生物体的正常生命活动，必然就会导致疾病，细胞的死亡使正常细胞结构消失、功能异常，也必然导致疾病。
代谢是生物体内一切用于维持生物体各项正常生命活动而进行的各种化学反应的总称。正是由于这些化学反应，生物体或者细胞才能够进行正常的繁殖和生存。代谢可以被认为是生物体不断进行物质和能量交换的过程，生物体的正常生命活动离不开细胞代谢，细胞代谢停止了，生物体内不能进行物质和能量的交换，有用的物质吸收不了，有害的物质排不出去，需要能量的地方没法传送能量，那么生物体的生命迹象就会停止，各种生命活动也会消失，就是我们说的死亡。婴幼儿、青少年正处在长身体过程中，所以在建造自身的机体的时候就需要更多的物质来维持，因此就是说年轻的生物体和细胞的新陈代谢旺盛，有用的物质能很快吸收，有害的物质能很快排除，因此就减少了疾病的发生，另外同化作用也占主导位置。这就是为什么年轻人不容易生病身体健康的原因。然而到了老年和晚年，人体机能渐渐开始退化，同化作用与异化作用都有所下降，细胞新陈代谢也就逐渐缓慢，就和年轻人不一样了，免疫力下降各种疾病就会随之而来。只要是正常的生命活动细胞新陈代谢就不会停止。例如动物的冬眠，虽然它们不进水不进食，但是细胞新陈代谢并未停止，只不过变得比平常的时候缓慢。新陈代谢是生命体不断进行自我更新的过程，如果细胞新陈代谢受到抑制，各种危害我们身体健康的不利因素也就随之而来。而其中最常见的就是代谢性疾病。
代谢性疾病即因代谢问题引起的疾病，包括代谢障碍和代谢旺盛等原因，主要包括以下这些疾病：1.糖尿病；2.糖尿病酮症酸中毒；3.高血糖高渗综合征；4.低血糖症；5.痛风；6.蛋白质-能量营养不良症；7.维生素A缺乏病；8.坏血病；9.维生素D缺乏病；10.骨质疏松症。
细胞代谢受到抑制通常也会引起退化性疾病，按照现在的说法，我们所知道的癌症和不育只是所有退化性疾病中的两种。其它的退化性疾病还包括老年痴呆症、糖尿病、心脏病、肥胖症、高血压、关节炎等等。人类只有一种疾病，那就是细胞代谢障碍或故障。细胞故障可以不同形式和不同程度出现，分布在不同部位，表现为不同症状。当所有细胞代谢正常时，人体处于健康状态。细胞出现代谢障碍有两个根本原因：细胞得不到它所需要的东西（营养不良），或者被它所不需要的东西伤害（毒素超载）。
除了环境突变或发生事故，疾病不会突然出现。生病是一个过程，只有当大量机体细胞（组织）出现故障时，才会在机体组织层面出现明显的病症，或有明显的感觉（不舒服）。例如，肥胖是机体细胞的脂代谢障碍，脂肪代谢障碍也叫脂肪重新分布，由于细胞代谢受到阻碍，你身体生产、利用和储存脂肪就会紊乱。而癌症则是机体细胞的氧代谢障碍。其实癌症并不神秘，由细胞中毒，导致“断迅、缺氧和糖化”产生。中毒使细胞通讯失灵，与免疫系统失去联系，变得毫无目的和不受限制。缺氧使细胞原始化，失去分工，开始像原始细胞那样繁殖。糖化提供了细胞在厌氧状态下复制繁殖所需要的营养。癌症病人通常有接触或摄入化学品、便秘、食欲下降和食用糖或淀粉的历史。2型糖尿病是细胞的糖代谢障碍，实际上是大量机体细胞对胰岛素敏感性的下降，其形成过程需要十到二十年的时间，最终才会出现口渴、饥饿、多尿、消瘦和高血糖。同样的道理，心脏病和癌症的形成通常也需要一二十年的时间。
当细胞被各种重金属、农药、药物或化学品入侵时，细胞核和DNA遗传信息可能就会受到污染而破坏，细胞膜的传送物质能力就会受到抑制，细胞间的通讯就会中断，物质无法传送，就会产生各种疾病。如果由于细胞间的通讯中断，自然细胞和免疫系统就不会产生联系，因此细胞处于原始状态的厌氧细胞在糖的无氧酵解中不受限制，可能发生毫无目的分裂和复制，就会产生癌变。
总而言之，细胞作为生物体的不可缺少的进行生命活动的个体，要想研究疾病就离不开对细胞的研究，疾病中的一切问题最后寻找到根一定是要从细胞中寻找原因。而细胞代谢又是研究各类疾病的有力途径。深入研究学习细胞代谢活动就会寻找出一切致病的原因，疾病的过程，治病的方法，防病的措施。所以对细胞代谢的深入研究一定会找到解决各种疑难杂症的方法，这种研究必将造福全人类。
参考文献：
[1]陈蕾，贾伟平，陆俊茜.《中华心血管病杂志》[J].2003第31期34—53
[2]仝小林，段军.《中日友好医院学报》[N]2002第16期
[3]顾东风，ReynoldsK，杨文杰.《中华糖尿病杂志》[J].2005第13期13—21
[4]杜月娟，郑国贤.《中国实用医药》[J].2007第12期45—53
[5]李兴杰，陈超.《生物学通报》[N].2009第6期
细胞是生物体结构和功能的基本单位，细胞生物学就是研究细胞结构、功能及生活史的一门学科。学习细胞生物学，在细胞和分子水平上了解和认识细胞的结构和功能及细胞的各种生命活动规律，可加深学生对生命现象本质的理解和认识，培养学生的科学思维和科研素质，为学生将来的科学研究工作奠定坚实的基础。早在90年代中期，国家自然科学基金委员会就组织一批细胞生物学方面的专家就我国细胞生物学发展的13个方面的研究制定了战略规划。近年来随着细胞生物学研究的不断深入，学科发展极为迅速，已成为生命科学领域的前沿学科，诺贝尔生理与医学奖大都授予了从事细胞生物学研究的科学家。随着科学的发展，细胞生物学的新成果、新技术不断涌现，导致细胞生物学教学内容多、学时少的矛盾日益突出，给教学带来很大压力。为此，我们多次对教学内容进行补充和修改，使其尽量体现时代特征和时代要求，同时不断更新教学方法和教学手段，在发挥教师课堂主导作用的同时，激发学生的学习兴趣，有效地提高细胞生物学理论科教学的质量。
1、积极更新教学内容
1）根据教学目标，制定教学内容
在细胞生物学理论课教学中比较普遍的问题是课时少，内容多。这就要求在有限的教学时数内，必须将内容进行合理安排，最大程度的将最需要的知识传授给学生，提高课堂的效率。首先对一些了解比较清楚，难度不大的内容，减少了讲解的时间，建议学生自学，有效的提高了课堂的效率。其次是针对一些与生物化学、遗传学、生理学、组织学等相关学科内容有所交叉的教学内容进行遴选，尽量减少相近学科间内容的重复，同时保证了教学内容的完整性。例如线粒体内膜的电子传递链在生物化学中已经学过，在细胞生物学的教学中，这部分内容就简要带过。
2）引进研究进展，完善教学内容
细胞生物学是世界上最热门的研究领域之一，科研成果层出不穷，是紧跟时代前沿的，关注热点问题的教学内容，对激发学生的学习兴趣具有重大意义。我们根据专业需要，把最新科研成果和亟待解决的关键问题融化到教学内容中，让学生及时了解学科的发展动态和国际前沿进展，这对细胞生物学教师提出了更高的要求。教师必须超越书本，走在知识的前沿，引导学生去探索未来发现新知识的热情和动力，发展学生的发散性思维能力，不断增强学生的自觉性和创造性（1）。例如美国科学家安德鲁?菲尔和克雷格?梅洛发现了核糖核酸（RNA）干扰机制获得2006年诺贝尔生理及医学奖；美国科学家伊丽莎白?布莱克本、卡罗尔?格雷德和杰克?绍斯塔克发现了端粒和端粒酶是如何保护染色体，获得2009年诺贝尔生理及医学奖，我们都第一时间在课堂上从研究背景、实验设计，研究过程、研究成果意义及应用等多方面进行了详细的介绍，开拓学生的视野。我们还鼓励学生积极参加学校学院组织的国内外知名专家的专题讲座，了解学科的前沿动态，为其进一步发展奠定了基础。
3）注重实验设计，培养科研思维
细胞生物学作为一门实践性强的学科，其理论都是建立在科学实验的基础上，在课堂上不仅要介绍已经得出的研究结果和结论，还要适当加入前人的研究思路和方法，启发学生独立思考，激发学生的科研兴趣，培养学生的科研思维。课堂或课后留一些思考题，引导学生生查阅文献自学，锻炼文献阅读的能力，进而培养学生自己发现问题并解决问题的能力。引导学生尝试自己为自己提问题，并设计解决问题的实验方案，逐步培养学生的科学思维方法、科学创新精神和实验设计能力。鼓励学生进入科研研究室感受科研氛围，了解实验室研究方向和实验设计，并进一步学习科学研究的方法，效果显著，部分学生通过在研究室的学习，本科阶段就在国家期刊上发表了研究论文。
2、不断改进教学方法
1）合理利用多媒体
细胞生物学作为一门专业基础课，课程内容信息量大，部分基础理论抽象，学生学习时普遍感觉内容多，难度大，学生往往觉得内容枯燥，很难掌握。而且细胞生物学在讲授细胞的结构与功能时需要有大量的细胞超微结构示意图，如果在黑板上绘制或挂图等形式，对教师来说不仅浪费时间，而且缺乏准确性和动态感。尤其细胞生物学本身还是探索生物体细胞发生、发展、成长、衰老死亡的生命活动规律的科学，这些动态过程是无法手绘的，多媒体课件很好的解决了这个问题。多媒体教学形象生动、交互性强、可视性好，有助于学生理解和掌握知识要点（2）。2005年，我们自己制作了多媒体课件，课件中大量采用外文细胞生物学图书上的彩图及光盘中的多媒体动画，借助丰富多彩的图片，使细胞的各部分结构一目了然，利于学生的掌握，加深了记忆。特别是对于细胞中信号转导，微丝的聚合和解聚，肌肉收缩，细胞运动等细胞内的动态过程，利用多媒体动画进行直观的模拟，以动态的观点看待细胞的各种生命活动现象，学生更容易理解和接受知识并激发了学生浓厚的学习兴趣，节省了课堂时间。但多媒体教学可能会出现授课过程中速度过快，内容多，容易造成做笔记和理解课程内容之间的矛盾，因此制备多媒体课件文本资料要干练，图片和动画选择要精致，章节提纲和标题要醒目，教师讲课思路要清晰，框架性好；讲师讲课语速适当减慢，以理解重点难点问题为主，可以课后将课件拷贝给学生，方便学生结合教材进一步总结和归纳。
2）强调启发式教学
改变传统的教师在台上照本宣读，学生在台下死记硬背的僵化做法。在备课过程中准备一些启发性问题，并在讲授的适当时机提出来，启发学生积极思考，这种启发式教学能充分调动学生的学习主动性，并培养其思考和解决问题的能力。在教学过程中，并不是将所有的教学内容和结论都显示出来，而是将有关内容以问题的形式提出，给学生以思考的余地，经过思考得出的结论，记忆深刻，学习积极性高，同时可以使学生按照教师的思路进行学习，更易于理解难点问题。例如，在介绍染色体DNA三种功能性元件时，先讲解利用不同组合将一种或几种DNA功能性元件转入亮氨酸合成酶缺陷型酵母细胞中的实验结果，要求学生根据实验结果进行思考分析并最终得到三种功能性元件的作用。通过这种方式不仅锻炼了学生的科研思维能力，而且加深了记忆，比教师直接讲授的印象深刻得多。
论文摘要:细胞凋亡又叫细胞程序性死亡，是植物正常发育中必不可少的一部分，目前已成为植物细胞生物学研究的一个热点。本文对植物凋亡的一般特征、植物营养和生殖生长中的细胞凋亡以及植物-病原物互作中的细胞凋亡进行了综合评述，并对植物细胞凋亡研究的现实意义进行了探讨。
细胞凋亡是多细胞生物体在生理或病理条件下部分细胞所采取的一种由内在基因编程调节，通过主动的生化过程而自杀死亡的方式[1]。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以常常又称为细胞编程性死亡。细胞凋亡的现象最早是Kree在1965年观察到的，经过进一步深入研究之后，他于1972年将其重新命名为细胞凋亡。之后近20年，细胞凋亡的研究主要集中在动物，人们越来越认识到细胞调亡在动物生长发育中、尤其在维持动物体内细胞和组织平衡、特化、形态建成和防病、抗病过程中的重要作用。同动物一样，在植物生长发育中也存在着细胞凋亡现象。但由于植物生长发育和细胞结构的特殊性，有关植物细胞凋亡的研究起步较晚。近年来，随着植物细胞凋亡的研究进展，人们逐渐认识到细胞凋亡是高等植物生长发育的必要组成部分，同时也是植物体度过不良环境的重要手段。目前，植物细胞凋亡的研究已成为近年来植物细胞生物学的新兴研究领域和热点之一。本文就植物细胞凋亡的一般特征、检测方法、在植物中的存在及意义作一综合阐述。
1植物细胞凋亡的一般特征
经历细胞凋亡过程的细胞呈现一些典型的形态学变化，光学显微镜或电子显微镜观察可见:细胞体积缩小，染色质凝集、断裂、趋边化，细胞器解体、消失，细胞膜发泡形成凋亡小体(其中包含有凝集的细胞核断片和细胞器)[3.4]。随着研究的深入，分子生物学证据也逐步被阐明:细胞染色质DNA在核小体连接部位断裂，其片段大小为200bp的倍数，经琼脂糖凝胶电泳可见到特征性的DNA梯度(DNAladder)，此特征还可以通过超速离心、末端标记电泳以及原位缺口翻译技术等进行定性、定量测定。细胞形态学和分子生物学的变化是细胞凋亡的重要诊断依据。
2细胞凋亡的检测方法
2.1细胞形态学观察法
苏木素-伊红(HE)染色法:石蜡切片的HE染色是组织形态学检测的常规方法，光学显微镜下细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单个散在分布，表现在核染色质致密浓缩，核碎裂等。
(1)电子显微镜。电镜观察，凋亡细胞染色质固缩，常聚集于核膜上呈境界分明的块状或新月形小体，初期细胞可见完整的细胞器，细胞膜完整，凋亡小体形成。目前一致认为，电镜下获得凋亡细胞特征性的形态学改变是判断细胞凋亡的最可靠依据。
(2)荧光显微镜。对体外培养的活细胞经荧光色素处理，可在荧光显微镜下观察细胞形态改变。常用荧光色素有吖啶橙、Hoechst33258或Hoechst33342、碘化丙啶(PI)、溴乙锭(EB)。前两种可分别进入活细胞和死细胞，而后两种荧光素仅能进入死细胞。不同的荧光素使核着染不同颜色的荧光，正常细胞呈均匀荧光染色，而凋亡细胞呈致密浓染的颗粒状或块状荧光。
2.2反映凋亡细胞膜改变的方法：染料排斥法。
除了电镜能反映细胞膜完整性外，还可用染料排斥法，如台盼蓝、PI等。坏死细胞膜破损，被染料着染。而凋亡细胞细胞膜完整，不被着染。但在体外培养的细胞最终也会发生继发性坏死。因此，此法不能单独用来判断凋亡细胞。另一种方法是判断胞质膜的不对称性。在正常细胞膜上，磷脂酰丝氨酸基团(PS)位于胞内侧，而在细胞凋亡早期膜上此基团则转向胞外侧，以利于被吞噬。因此，磷脂酰丝氨酸基团位置的改变，可作为凋亡细胞的一个标志。
2.3反映脱氧核糖核酸有规律断裂的方法
细胞凋亡过程中，DNA有规律地断裂可以通过下述几种方法检测出来。
(1)琼脂糖凝胶电泳法。细胞悬液经裂解消化按常规法提取DNA后，于含EB的琼脂糖凝胶中进行电泳，正常细胞DNA呈单一条带。细胞凋亡时呈典型的梯状条带，系180～200bp左右的及多聚核小体的梯状DNA条带。坏死时则呈现模糊的弥散状条带。DNA电泳法是判断细胞凋亡的经典方法.PEG6000诱导的小麦叶片[7]、羟自由基诱导的烟草细胞[8]、细胞色素c诱导的胡萝卜和烟草原生质体[9]和乙烯诱导的胡萝卜原生质体[10]发生PCD时均检测到DNA梯状条带。
(2)流式细胞仪检测法。细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用萤光素染色利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞萤光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
(3)原位末端标记法(InSituEnd2Labeling，ISEL)。通过DNA多聚酶I把已标记的核苷酸结合到DNA的单链断裂处，以寻找有无Ap发生。标记的方法有同位素标记、荧光素标记、地高辛或生物素标记等。
(4)原位切口平移法(InSituNickTranslation，IS2NT)。利用DNA多聚酶将核苷酸整合到Ap细胞内断裂的DNA3′羟基末端，同时水解5′末端，以修复DNA。若用已标记的核苷酸，即可显示出有断裂DNA的细胞。该法同样也可用于细胞悬液中Ap的观察。
(5)末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT2me2diatedX2dUTPnickendlabeling，TUNEL)。末端转移酶(TdT)介导的X2dUTP缺口标记法是目标原位检测Ap最为敏感、快速、特异的方法，其具有广泛的应用前景。末端转移酶(TdT)可催化在DNA片段的3′羟基末端合成多核苷酸聚合物的反应，即DNA片段加尾。利用末端转移酶(TdT)将标记的脱氧核苷酸转移到DNA缺口或3′羟基末端上，通常所用的核苷酸为dUTP，标记物为地戈辛、生物素、荧光素等。
(6)ELISA法。对Ap细胞内DNA片段的检测还可用ELISA法。悬浮细胞经裂解，高速离心去除核的成分后，取上清加入已包被有抗组蛋白抗体的反应板，反应后再加酶标抗DNA抗体，若上清中含断裂的DNA片段，则可通过此双抗体夹心法得以检出[11]。
3植物发育过程中的细胞凋亡
萌发的种子中的糊粉层、维管束的木质部、生殖器官的组织(如花药和子房)及根冠等组织中均有细胞凋亡的发生[12]。虽然在细胞水平上，与细胞凋亡相关联的水解酶的激活、一些蛋白的失活以及核DNA的断裂都可以经常观察到，但是这些现象的发生机制到近来才有所了解。
3.1导管的形成
导管是由排列有序的死亡的导管分子(trachearyelements，TEs)构成。王雅清和崔克明[13]对杜仲木质部导管分化的研究证明，其分化过程也发生了细胞凋亡。所有这些研究都表明木质部导管分化与细胞凋亡有密切关系。玉米生长过程中在一定条件下根部皮层细胞崩溃死亡形成通气组织，而通气组织与植物的同化、呼吸、蒸腾作用都有密切关系[14].
3.2单性花的形成
许多单性花植物在花原基分化时存在雌蕊和雄蕊原基细胞，在后期发育的特定阶段雌蕊或雄蕊原基细胞出现细胞凋亡，从而最终形成单性花。
3.3大、小孢子的形成和发育
大多数种子植物中，大孢子母细胞减数分裂形成4个大孢子。仅有1个能发育成雌配子体，其余的3个大孢子退化。例如，蕨类植物大孢子母细胞减数分裂产生4个大孢子，这4个大孢子通常呈线型或T型排列，仅有1个能继续发育成雌配子体，其余3个都死亡。对其超微结构的研究表明，其退化解体过程也符合细胞凋亡的基本特征[15]。
3．3雌雄配子体的发育
植物中雌雄配子体的发育有细胞凋亡参与其中。裸子植物雄配子体发育过程中，原叶细胞的退化和雌配子中颈细胞、腹沟细胞的消失及珠心细胞的衰退也是细胞凋亡的结果。在被子植物雌配子体(胚囊)发育过程中，珠心组织被作为营养物质吸收而退化的过程是细胞凋亡[16].
3．4胚的发育
在胚性细胞分化和发育过程中，存在着细胞凋亡[17]。植物的胚由受精卵发育而成，在胚的形成过程中，助细胞、反足细胞和胚柄细胞都因发生细胞凋亡而消失。胚柄由受精卵第一次分裂形成，当胚发育到一定阶段，胚柄发生细胞凋亡，形态上表现为质壁分离，原生质体固缩。单子叶植物的种子中，在胚和胚乳之间有一层或几层排列整齐的糊粉层细胞，含大量糊粉粒。胚胎发育早期由胚柄提供营养形成种子，后期则通过糊粉层细胞形成分泌组织，分泌水解酶，水解胚乳成分，种子萌发后，糊粉层功能完成，便开始凋亡，是典型的细胞凋亡。在种子萌发过程中，其他胚乳和无胚乳种子子叶中一些贮藏细胞也会发生类似的细胞凋亡，没有这些细胞凋亡，幼苗就不能正常生长发育，会因饥饿而死亡。
3.5根冠细胞的死亡
根冠位于根尖的顶部，是由许多薄壁细胞组成的冠状结构。在根的发育过程中，根冠细胞不断脱落，并由顶端分生组织不断产生新的细胞，从内侧补充使根冠细胞得以保持定数。对根冠细胞脱落的研究证明，其脱落过程是典型的细胞凋亡。正是这些细胞的主动死亡，才保证了根顶端分生组织在生长过程中避免与土壤磨擦而受伤，进而保证了根的正常发育。对玉米根尖进行低温胁迫或用细胞毒素类药物如放线菌D、秋水仙碱处理后，这些根尖分生组织细胞同样具有DNAladder、染色质和细胞核浓缩等特征，说明环境因子和药物也可诱导根尖细胞发生凋亡[19.20]。
3.6叶发育过程中的细胞凋亡
在叶子的发育过程中，叶缘的各种裂、齿和叶片中的空洞(如龟背竹叶片)的形成等都是由于相关部位细胞的凋亡所造成的。此外，对叶片衰老过程的研究发现，衰老起始时，叶绿体首先被自体吞噬，此后水解酶、RNA酶等活性上升，而且以液泡内半胱氨酸蛋白酶活性最为显著[21]，这些都是细胞凋亡的特征。因此，叶子脱落前叶片的衰老过程也是PCD。
4环境胁迫诱导的植物PCD
4.1植物超敏反应中的PCD
超敏反应(hypersensitiveresponseHR)是植物被病原物侵染后所引起的适应性反应，其中的细胞死亡被证明是细胞凋亡。在植物超敏反应中，DNA片段化，特征性切割核小体的核酸酶被激活等生理生化特征和凋亡小体等形态特征都被证实。转贴于
4.2盐胁迫诱导的PCD
无机盐KCN、NaCl、CaCl2和一些重金属离子等在一定条件下均可诱导植物细胞出现与动物细胞凋亡类似的特征。宁顺斌[22]等人的实验证明烟草、玉米的根尖在高盐(NaCl500mmol/L)处理后，出现明显的DNA梯状电泳图谱。林久生和王根轩[23]用20%PEG溶液(-0.63MPa)对小麦根系进行渗透胁迫，在小麦叶片DNA琼脂糖凝胶电泳图谱上观察到明显的梯状DNA条带，表明PEG处理诱发了DNA核小体间的断裂，末端脱氧核糖核酸转移酶介导的3’OH末端标记法(TUNEL)检测出现阳性结果。
4.3活性氧与植物细胞凋亡
活性氧是一类具有强氧化能力的物质，主要包括超氧化物、过氧化氢、羟自由基等，各种逆境条件，包括冷害、渗透胁迫、低氧、臭氧、紫外线等导致的植物细胞凋亡最终都与活性氧的产生有关。当细胞外一些信息如辐射、高温等通过细胞活性氧传入细胞引起其脂质过氧化或与细胞凋亡有关基因的表达时，细胞也会凋亡[24]。陈明等[25]研究发现以一氧化氮(NO)供体硝普钠(SNP)处理小麦可以明显提高ROS清除酶，如过氧化物酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸氧化酶等活性，从而清除因盐胁迫产生的氧自由基或活性氧ROS，或直接清除ROS来保持细胞处于还原状态。
5研究植物细胞凋亡的意义及展望
导管细胞的退化死亡、筛管细胞原生质的自溶，形成了植物体的输导组织;这些细胞死亡之前，细胞内物质可被其他细胞回收利用，这是植物能够独立营养的一个特性，叶片衰老死亡即是适应营养重新分配的结果，但这个过程却影响了农产品的产量。因此，要搞清植物细胞凋亡的发生程序，对粮食生产及作物储藏技术改良都具有重要的现实意义。在超敏反应中，被病原体感染的宿主细胞采取主动死亡的方式，从而限制感染部位病原菌的生长，阻止病原菌的传播，以达到防病抗病的目的。这种植物自身的主动抗病反应，若在植物抗病育种中加以应用，使植物能够自动、有效地抵抗病原物的侵染，就可以减少农药的使用，避免环境污染，从而提高人类生活质量。
由于植物细胞凋亡的同步性很低、凋亡时间很短，同时由于细胞内各种因子相互作用，调控机制及其复杂，使分子生物学技术应用于细胞水平的研究存在很大困难。近年来，利用非细胞体系来研究细胞凋亡的模式的建立和应用弥补了上述不足。有研究表明[26]，利用非细胞体系研究细胞内复杂的生化活动具有独特的优越性，在细胞周期调控、DNA复制、核小体与染色质构建等研究中发挥了重要作用。非细胞凋亡体系的建立与利用，在很大程度上促进了人们对植物细胞凋亡生化和分子机制的研究，为植物细胞凋亡研究开辟了新途径。
随着植物细胞凋亡的研究的逐步深入，发现植物细胞凋亡需要研究的方面还很多。植物体发生细胞凋亡的机理还不清楚，植物细胞中与细胞凋亡有关的基因研究还远没有动物深入。尽管许多实验表明植物细胞凋亡与动物是相似的，但分子水平共同特征少，目前仅发现少数几个基因参与植物细胞凋亡的过程[27]。研究过程中常局限于某一特定现象，很少有将这些现象和植物发育的具体过程联系起来，加上植物生长周期较长，给研究带来一定困难。植物细胞凋亡的研究如果能与植物的经济利用联系起来，将具有重要实践价值。如能发现诱导果实发育中细胞凋亡发生的因子，通过人为调控，改变生长发育期，提高果品产量和品质，则将会极大地推动果树现代化生产的发展。
参考文献
[1]张亚历等.编程性细胞死亡及研究方法[J].细胞生物学杂志，17(3):127-128.
[2]蒋争凡，翟中和.细胞凋亡[J].科学通报，1999，44(18):1920-1928.
[3]宝福凯.编程性细胞死亡的研究现状及展望[J].1995年，细胞生物学杂志，17(3):122-126.
[4]杨帆，王文亮，王伯云.细胞与分子免疫学杂志，1997，13（1）：8—9
[7]林久生，王根轩.渗透胁迫诱导的小麦叶片细胞程序性死亡.植物生理学报，2001，27:221～225.
[8]夏慧莉，陈浩4华志明，陈睦传，沈明山.生物工程进展，1998，18（3）：32—36
[9]孙英丽，赵允，刘春香，翟中和.细胞色素c能诱导植物细胞编程性死亡.植物学报，1999，41:379～383.
[10]周军，朱海珍，姜晓芳，戴尧仁.乙烯诱导胡萝卜原生质体凋亡.植物学报，1999，41:747～750.
[11]张伟成，严文梅，娄成后.小麦衰退珠心中解体原生质体向胚囊的迁移及其对增殖中反足细胞的哺育[J].植物学报，1984，26(1):11221.
[12]郭小丁.植物细胞的编程性死亡[J].1998年，植物学通报，15(5):40-43.
[13]王雅清，崔克明.杜仲次生木质部导管分子分化中的程序性死亡[J].植物学报，1998，40:1102-1107.
[14]华志明，陈睦传，沈明山.细胞生存与死亡的社会控制[J].1998年，生物工程进展，18(3):32–36
.[15]陈朱希昭，陈耀堂，高信曾.太谷核不育小麦花药组织和小孢子发生的超微结构研究[J]1植物学报，1984，26:235–240
[16]尤瑞麟.小麦珠心细胞衰退过程的超微结构研究[J].植物学报，1985，27:345-353.
[17]邢更妹，李杉.植物体细胞胚发生中抗氧化系统代谢动态和细胞程序性死亡[J].生命科学，2000，12(5):214-216..
[19]宁顺斌，宋运淳，王玲，等.低温胁迫诱导玉米根尖细胞凋亡的形态和生化证据[J].植物生理学报，2000，26(3):189-194.
[20]宁顺斌，宋运淳.药物诱导的玉米根尖细胞凋亡[J].植物学报，2000，42(7):693-696.
[21]杨征，蔡陈凌，宋运淳.植物细胞凋亡研究进展[J].生物化学和生物物理进展，1999，26(5):4392443
[22]宁顺斌，宋运淳，王玲等.盐胁迫诱导的植物细胞凋亡———植物抗盐的可能性生理机制[J].实验生物学报，2000，33(3):6132623.
潘建伟，陈虹，顾青(2002)环境胁迫诱导的植物细胞程序性死亡.遗传，24:385-388
[23]林久生，王根轩.渗透胁迫诱导的小麦时片细胞程序性死亡.植物生理学报，2001，27(3):221~225
[24]吴逸，戴尧仁.羟自由基诱导烟草细胞凋亡.植物生理学报，1999，25:339～342.
[25]陈明，沈文飚，阮海华，等.一氧化氮对盐胁迫下小麦幼苗根生长和氧化损伤的影响.植物生理与分子生物学学报，2004，30(5):569~576
关键词：血清药理学；肿瘤；细胞凋亡；三磷酸腺苷酶；葡萄糖-6-磷酸酶
中图分类号：R285.5文献标识码：A
文章编号：1673-7717(2008)05-1108-02
ResearchApplicationofBloodSerumPharmacologyMethodonInductionofTumorCellApoptosisandLoweringofEnzymeActivity
CAIShuo1，LIUShan2，ZHANGLihong1,JinChunfeng1,LiuChunying1
（LiaoningUniversityofTCM,Shenyang110032,LiaoningChina；2.FourthPeople'sHospitalofShenyang,Shenyang110032,Liaoning,China）
Abstract：Objective:Toexploretheapplicationofbloodserumpharmacologymethodintheresearchofinducingcellapoptosisandreducingtheenzymeactivity.Methods:UsingChinesenativemedicineserologymethodoftreatingthelivercancer,stomachcancer,lungcancer,bigcanceroftheintestinestodiscusstheeffectofinducingtumorcellapoptosis,reducingtheenzymeactivityofATP(Mg2+-ATPase)andtheglucose-6-phosphatase(G-6-Pase)oftumorcell.Results:①FourkindofdifferentcompoundChinesemedicicalbloodserumallcaninducethecellapoptosisofcorrespondinglivercancercelllines,A549humanlungcancercelllines,CCL229humancolorectalcarcinomacelllinesandcelllineSGC7901.②TheactivityofATPandGlucose-6-phosphataseintumorcellisdecreased.Conclusion:Theresearchapplicationofbloodserumpharmacologymethodontheinductionoftumorcellapoptosisandtheloweringofenzymeactivityhasthestabilityandthecredibility.
Keywords:bloodserumpharmacology;tumor;cellapoptosis;Mg2+-ATPase;glucose-6-phosphatase
20世纪80年代中期，日本学者IwamaH等率先提出“血清药理学方法”。此法是先给动物灌胃给中药，一定时间后再采集、分离其血清，并用此含药血清进行体外实验[1]。血清药理学方法已被广泛用于中医药作用机制的研究，研究层面已涉及到细胞增殖、分化、凋亡与细胞周期的调节以及基因表达等方面。本研究采用治疗胃癌、肝癌、肺癌、大肠癌等中药血清学方法，深入探讨其诱导肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤细胞三磷酸腺苷酶（Mg2+―ATPase)与葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)酶活性作用。
1实验方法
1.1细胞培养主要试剂抗肝癌、胃癌、肺癌、大肠癌等不同中药复方中的中药，均由辽宁中医药大学第一附属医院提供。
1.2中药制剂制备将3个不同中药复方组成后传统煎制：中药清水浸泡2h，煮沸后文火煎15min，纱布过滤取汁，药渣加水再煎20min，两次药汁混合，浓缩为100%。
1.3药物血清制备动物：SD大鼠由辽宁中医药大学实验动物中心提供。30只SD大鼠随即分为3组，即中药组10只，化疗组10只，对照组10只。实验前禁食12h，采用2次给药方法（第1次给药2h后重复等量给药1次），每100g大鼠灌胃中药制剂1mL，2次/日连续灌胃3天。化疗组、对照组生理盐水等量灌胃3天。分别在末次给药后1、2、3h采血，戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下，下腔静脉取血，静置4h，4℃，3000r/min20min离心，分离血清，同种条件药物血清混匀，过滤，56℃30min灭活，-20℃保存，备用。
血清分组：中药血清组（中药组）、化疗血清组（西药顺铂-DDP组）、对照血清组（对照组）。（1）中药血清组：临用前将中药组大鼠血清加入PRMI1640培养液，浓度分别为5%、10%、20%。（2）化疗血清组：用含10%化疗组大鼠血清PRMI1640培养液，DDP的终浓度为5%、10%、20%。（3）对照血清组：大鼠血清中加入PRMI1640培养液，终浓度为5%、10%、20%。
1.4细胞株肝癌细胞株、SGC7901胃癌细胞株、细胞株A549人肺癌细胞株和CCL229人大肠癌细胞株和均由中国医科大学生物教研室卫生部重点实验室提供。
2细胞培养
将细胞从冻存于液氮中的安瓶取出，放入37～40℃水浴中1min内融化，无菌条件下打开安瓶，接种于2只无菌培养瓶中。加入10%小牛血清PRMI1640培养液，在5%CO2，37℃条件下CO2培养箱中培养，倒置显微镜下动态观察细胞形态，24h后见细胞贴壁生长状态良好，弃培养液，分别加入各组血清，继续培养。
3标本制备
3.1细胞凋亡生长在培养瓶内的贴壁细胞用2.5%戊二醛4℃原位固定2h，用橡皮铲刮下细胞，转至离心管内，低温高速离心机2000r/min，15min，琼脂处理成块，PBS冲洗，1%锷酸（OsO4）后固定1.5h，梯度乙醇、丙酮脱水，Epon812树脂包埋，超薄切片机（LKB-V）切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜（JEM-1200）观察、摄片。
3.2酶细胞化学取出培养皿中的载片，PBS冲洗，2%多聚甲醛固定30min，8%蔗糖脱水，3次×30min，分别加入Mg2+-ATP酶和G-6-P酶孵育液，37℃孵育45min，双蒸水冲洗，2min×3次，2%硫化铵成色，2min，双蒸水冲洗，2min×3次，梯度乙醇脱水各10min，甘油明胶封片，普通光镜下观察、拍片。
4结果
4.1细胞凋亡①正常对照组：各组肿瘤细胞株多为长梭形，表面可见较多的微绒毛，线粒体、粗面内质网、高尔基复合体、溶酶体等细胞器丰富、排列规则。②中药组：细胞表为椭圆形、圆形。表面微绒毛明显减少、消失。胞浆浓缩，可见大小不等的空泡，泡内容物电子密度与机制相似。细胞核变小、不规则，染色质浓缩、边集，呈断裂状，部分线粒体肿胀、空泡化。可见到典型的凋亡小体：圆形，可见从凋亡细胞脱落。位于凋亡细胞一侧，表面有完整的细胞膜包裹，小体内可见染色质碎片及破碎的内质网、囊泡化的线粒体等结构。③化疗组：结果与中药组相似，可见典型的凋亡小体。
4.2酶细胞化学①Mg2+-ATP酶：光镜下可见对照组细胞Mg2+-ATP酶主要定位在细胞膜内侧，黑色酶反应颗粒大小均匀，密度大，呈线状规则排列，酶活性强。与正常组比较，中药组、西药组细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低。提示酶活性明显下降。②G-6-P酶：光镜下可见对照组细胞的G-6-P酶主要定位在细胞质内，酶反应颗粒粗大，排列密集，呈融合状，酶活性强。与对照组比较，中药组、西药组细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，西药组部分细胞为阴性。提示酶活性明显下降。采用Tiger图像分析仪测定Mg2+-ATP酶和G-6-P酶阳性细胞平均光密度（AOD）值，与对照组相比，P＜0.01。
5讨论
中药血清药理学方法是由日本学者于20世纪80年代首先提出来的。是给动物灌服中药一定时间后，取其血清进行实验的药理学研究方法。利用血清药理学方法，给大鼠灌服中药一定时间后，取出血清进行体外实验。能客观反映中药进入体内之后，经过消化、吸收、代谢等过程后发挥药效作用，中药血清药理学提示：中药复方诱导的肿瘤细胞株凋亡具有可靠性和可信性[2]。
本研究证实，4种不同中药复方的中药血清，均能诱导相应肝癌细胞株、A549人肺癌细胞株、CCL-229人大肠癌细胞株和SGC-7901胃癌细胞株发生凋亡，见到典型的形态学特征性指标――凋亡小体[3-4]。
Mg2+-ATP酶是质膜标志酶，主要定位于细胞膜内侧，此酶参与质膜上离子的主动转运，,维持细胞内K+和Na+浓度相对稳定状态,保持细胞膜内、外渗透压平衡以及参与保持细胞内外的化学梯度和跨膜电位，维持细胞内高钾低钠状态，从而保证细胞的活性。本实验中，药物血清作用后细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，提示酶活性明显下降。G-6-P酶是内质网标志酶，是一种多功能酶,是细胞内糖原异生作用中重要酶之一，被称为“代谢标志酶”之一。此酶在糖代谢、免疫球蛋白合成及其它蛋白质合成、浓缩、加工等方面发挥重要作用。本实验中，药物血清作用后细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，有的为阴性。提示酶活性明显下降[5-6]中药血清诱导肿瘤细胞凋亡，降低肿瘤细胞株酶活性可能是中药复方抗肿瘤的机理之一。笔者同样成功应用本中药血清药理学技术进行了胃癌宁对人SGC-7901胃癌细胞株p53、bcl-2基因表达影响的研究[7]。
（1）给药方案与采血时间。目前存在多种给药方案。但一般使用灌胃方式，也可通过皮肤、黏膜、呼吸道等途径给药。给药时间最短者为1天，最长者为10天；给药次数也各不相同，有每天2次的，也有每天3次的。尽管已有研究表明，连续用药5天和10天所制备的含药血清的生物学效应是相似的，但无论哪种给药方法都必须使药物浓度达到相对平衡状态。根据目前掌握的大量药物的有效成分的药代动力学数据，本实验采用与多数研究者一致的即时血清在实验前禁食12h，次日采用两次给药方式（一次给药后2h等量给药），连续灌胃3天，日两次；采血时相，分别在末次给药后1、2、3h采血。证明是研究中药复方作用肿瘤细胞株较为可靠的血清药理学方法血清[8-9]。（2）含药血清用量。目前中药含药血清的浓度还没有确切的规定，选用5、10和20浓度的含药血清进行实验所得结果的说法不一，进行细胞增殖抑制作用的实验采用高浓度的效果好，而进行细胞增殖促进作用的实验采用低浓度的效果好[10]，本研究采用10的平均浓度进行实验，结果较好。当然，最佳血清浓度是因不同实验而异的，故最好的做法是通过预实验来确定。血清药理学可较好地克服了中药粗制剂直接进入体外实验的缺点，其结果的可信度明显优于中药粗制剂直接用于体外实验，不仅提示中药制剂在胃肠内处理过程中活性成分的转化与改变，而且有利于中药真正有效活性部位、有效成分的发现，将有助于促进中药药理现代化的发展，为新药开发奠定能基础。本研究进一步证实，血清药理学方法在诱导肿瘤细胞凋亡、降低酶活性等研究中的应用具有稳定性、可信性。血清药理学方法的应用将更多的相关中药方剂引入抗肿瘤细胞凋亡及诱导细胞凋亡方面的研究，筛选有效的中药成分与其有效组方来达到诱导大量肿瘤细胞凋亡，揭示中药的抗癌机理，为中药治疗肿瘤提供科学、客观和现代的手段与方法，是今后研究的重要内容，对人类攻克肿瘤有着重大意义。
参考文献
[1]IwamaH.Effectofshoszikoto,aJapaneseandChinesetraditionalherbalmedicalmixtureonthemitogenicactivityoflipopolysaccharide.Anewpharmacologytestingmethod[J].JEthonopharmacal,1987,211:45.
[2]米永杰、李健。中药血清药理学研究进展[J].四川解剖学杂志，2006，14（4）：34-35.
[3]蔡朔，刘芙蓉，邵亚群．胃癌宁诱导人SGC-7901胃癌细胞调亡的实验研究[J].中华现代中西医杂志，2006，4（3）：206.
[4]刘春英，王哲，蔡朔，等．肺癌平诱导Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞凋亡的形态学研究[J].中国实验方剂学杂志，2005，11（2）：132-134.
[5]刘春英，王哲，蔡朔，等．肺癌平药物血清对A549人肺癌细胞株Mg2＋-ATP、G-6-P酶活性的影响[J].2004，11（11）：969-971.
[6]金春峰，刘春英，蔡朔，等．益肺饮对A549人肺癌细胞株酶活性的实验研究[J].中国肿瘤，2004，13（9）：588-590.
[7]蔡朔，刘芙蓉，刘山．胃癌宁诱导人SGC-7901胃癌细胞株p53、bcl-2基因表达影响研究[J].中华中西医临床杂志，2007，7（2）：9-12.
[8]刘成海，刘平，刘成，等．抗肝纤维化有效中药复方血清药理学方法探讨[J].中国实验方剂学杂志，1998，4(2)：16-17.
【关键词】三维细胞培养；肿瘤球聚体；生物材料；药物筛选
【Abstract】Three-dimensionalcellcultureinvitrocannotonlysimulatethemicroenvironmentofintercellularsignaltransductionbetweencellsandextracellularmatrix，butalsocanreproducetheconditionsincellculture.Inrecentyears，three-dimensionalcellculturetechnologyhasincreasinglywidelyusedinbiomedicalresearch，whichbecomesapowerfultoolfordrugtoxicityassay，tumormulti-drugresistance，high-throughputscreeningofanticancerdrugsanddrugmetabolism.Inthispaper，wegiveabriefreviewoftheirlatestresearchprogressonconstructionofthree-dimensionaltumorspheroidinvitro.
【Keywords】Three-dimensionalcellculture；Tumorspheroid；Biomaterial；Drugscreening
First-author’saddress：He’nanShuguangHZKBiologicalTechnologyStockCo.，Ltd，Luohe462332，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.09.050
细胞的生长环境和培养条件对细胞特定基因的表达及细胞的生物学行为能产生极大的影响，如细胞极性、结构、迁移、侵袭等[1-2]。目前，肿瘤的体外研究依然主要依靠肿瘤细胞的单层平面培养，然而传统单层培养的细胞无论是在形态、结构和功能等方面都与在体内自然生长的细胞有很大的差别，其无法真正反映体内呈三维状态生长的肿瘤。因此，在体外建立适合细胞和组织生长的生理微环境的三维细胞培养体系可方便地用于肿瘤侵袭和转移研究以及药物筛选的体外研究[3-5]。这种特定的类似组织样的三维微空间结构可以为体外生长的细胞提供类似体内生长环境的生物支撑或基质，建立细胞间及细胞与胞外基质间的相互联系。
由于在模拟细胞与细胞间、细胞与细胞外微环境相互作用方面的独特优势，近年来，三维细胞培养在肿瘤体外研究中获得广泛应用，成为肿瘤耐药、药物载体、药物毒理、肿瘤治疗、血管形成、信号转导、干细胞等方面研究不可或缺的有力工具[6-13]。特别是在抗肿瘤药物筛选方面，体外构建三维肿瘤球聚体与动物移植实体瘤模型相比，具有可重复性强、缩短研究时间、降低成本方面的优点，更不致引起动物伦理方面的争议。因而，在肿瘤体外研究中，体外构建三维肿瘤球聚体越来越受到研究者的青睐。
1体外构建三维肿瘤球聚体主要方法
1.1多孔支架培养法体外二维培养肿瘤细胞很难聚集形成球状体，最初一些研究小组开发了支架培养肿瘤细胞成球，这种培养方法是利用体外肿瘤球状体可由生长在预制支架上的肿瘤细胞产生，细胞吸附和移居在缠绕的纤维上，随着细胞的分裂，它们填充支架内的间隙，这样会形成三维球状体[14-15]。不过支架的组成成分会对培养细胞的性能有很大的影响，目前，最常用的支架是胶原，此外，细胞外基质蛋白（ECM）也经常一起使用，同时，辅以必要的生长因子，这能增加细胞生长和含有其他调节因子的可能性。支架也可以用原代细胞和小片组织灌输。这种方法是较早、最常用、也是研究得最多的一类。
1.2旋转培养法在旋转培养出现以前，三维细胞培养都是静态培养，静态培养不利于营养物质和代谢废物的运输，妨碍肿瘤实体瘤的生长，为了解决这方面的不足，后来许多研究小组开发了动态培养方法如旋转烧瓶、滚筒试管、回转振荡器等[16-18]。其中美国NASA开发的旋转细胞培养体系是最有效的旋转培养装置，其工作原理是：凭借模仿微重力，保持细胞在动态流体中。培养器皿整体沿着它的水平轴旋转，以便上下颠覆混合细胞。借助于容器内被介质完全填满，能使流体冲击力和剪切力降到最小，通过半透膜能对培养瓶通气，而且半透膜能通过水动力排除气泡。这种培养系统的优点是：成功地实现了三维基质相互作用，但剪切力却较低。它提供了具备物质运输静态的三维球状体培养的环境。这种方法应用较为广泛，但构造较为复杂，实现起来比较繁琐，这一定程度上影响了其应用。
1.3磁悬浮培养法在磁悬浮培养提出以前，虽然蛋白质凝胶培养、转动生物反应器培养的多种三维培养方法。但这些方法操作起来有一定难度，而且生物可降解多空支架能使细胞增殖和细胞相互作用延迟的缺点，在实际中未能广泛应用。因此开发一个可操作性强的三维培养技术，仍是非常需要的。后来，有学者提出三维磁悬浮培养方法，这种方法的原理是：依靠磁铁的磁力和细胞的悬浮[19]。噬菌体、磁性四氧化三铁以及金纳米颗粒形成水凝胶，细胞摄取水凝胶，在培养器皿盖上面放一块磁铁，这样培养液处在磁铁的磁场当中，四氧化三铁被磁化，细胞将自动吸附聚集在一起形成球体。这种技术的优点是金噬菌体水凝胶生物兼容性好。所以，这种技术可替代生物可降解多空支架和蛋白质基质培养等技术。细胞培养的实验结果证实这种方法更能维持培养细胞的体内生理、形态等特性。这种方法具有较大的应用潜力。
1.4纳米印迹培养板培养法随着研究工作的深入，各种三维培养基质不断出现，如被琼脂、胶原包被的塑料基质，不过这些介质不能保持细胞在体内的增值、生存活性、均一等特性。而且这些介质对显微成像和光谱光度检测产生影响。有学者开发了一种用纳米压印技术形成的无机纳米级支架培养方法[14]。这种培养方法是利用纳米印迹技术把纳米级直角坐标网格式压印在合成树脂底部，其优点是：减少了细胞与基质的直接接触，避免了对细胞生化和生理特性的影响，也能维持细胞的增殖和存活率，便利了三维球体的形成，而且形成的肿瘤细胞球与体内形成的比较类似。也便于显微观察和光谱光度测量。这种方法简便易行、可操作性强，受到不少研究者的青睐，但所形成细胞球的体积有限。
1.5实体瘤芯片在实体瘤芯片开发以前，常规悬挂滴注培养被广泛地用于癌症生物医学研究中的三维肿瘤实体瘤构建。但这种用这种方法形成的肿瘤球体需要抽取，之后需转接入其他培养装置中进行灌注培养，为了解决这个问题，后来开发了许多微流体球芯片，但这些芯片有的是静态培养，有的虽然是灌注培养，但需要笨重的流体泵[20-22]。最近，Taeyoon小组开发了一种实体瘤芯片，这种芯片能进行自动介质滴注[23]。其工作原理是：培养液由滴注分配层滴入，待达到一定的平衡液面，培养废液从排水口排出。该方法设计巧妙、结构简单、经济实用，是目前研究的热点。
2三维肿瘤球聚体的应用
三维细胞培养技术以其具有模拟体内微环境、较真实再现其功能的优势，现已在生物医学领域中广泛应用，近年来，分子生物学、生物力学、生物材料学、生物化学等诸多学科与组织工程学的不断融合促使体外细胞三维培养技术不断发展完善，培养条件逐渐接近体内环境，使目的细胞的结构和功能更接近体内状况。针对当前抗肿瘤药物筛选中，开大周期长、效率低、投入大等问题，根据具体情况，结合文中提到的这些方法可初步用于药物筛选的三维肿瘤模型及其芯片化装置。如以生物大分子（如蛋白质、多糖等）为主要原料的设计制备细胞培养三维支架方法；研究支架材料负载生物活性物质和支架材料的物理化学修饰对肿瘤细胞生长微环境和实体瘤形成的作用，并初步构建芯片器官综合体（或称芯片人体）中的芯片肿瘤组织单元，揭示肿瘤发生、转移的规律。发展体外自组织形成肿瘤细胞三维球聚体的新方法与新技术，研究肿瘤干细胞小生境的形成规律；发展体内实体肿瘤组织直接在体外培养的新方法与新技术，用于芯片恶性肿瘤模型的构建，研究其生物学特征，并可逐步用于抗肿瘤药物的大规模筛选与评价。
3展望
体外肿瘤细胞三维培养模型已经从早期的支架培养、旋转培养、磁悬浮培养，发展到实体瘤芯片[24-26]，已广泛应于抗肿瘤药物筛选研究中，其应用价值逐渐被研究者认同。可以预见通过这些方法构建的各种肿瘤模型将会与其他人体器官芯片（如：肝脏芯片、肺脏芯片、肾脏芯片等）整合在一起，为药物筛选及个体化诊疗提供依据[27-30]。同时，将会更有力的推动药物的研发。目前的迫切任务是规范这些研究所用的实验方法并探索实践新的技术方法，使其能被大多数研究机构接受。此外，还需进一步证实其可信性，以此获得管理部门的认可。此外，未来肿瘤细胞三维培养技术要求生物材料除了具有化学和工程学的功能以外，还需具有系统性的可控性，为生物医学研究提供具有良好功能的细胞、功能性三维组织、乃至功能性三维器官，满足大规模药物筛选的需求。
参考文献
[1]JacquemetG，HumphriesMJ，CaswellPT.Roleofadhesionreceptortraffickingin3Dcellmigration[J].Currentopinionincellbiology，2013，25（5）：627-632.
[2]KimlinLC，CasagrandeG，ViradorVM.Invitrothree-dimensional（3D）modelsincancerresearch：anupdate[J].MolecularCarcinogenesis，2013，52（3）：167-182.
[3]PercheF，TorchilinVP.Cancercellspheroidsasamodeltoevaluatechemotherapyprotocols[J].CancerBiology&Therapy，2012，13（12）：1205-1213.
[4]LaBarberaDV，ReidBG，YooBH.Themulticellulartumorspheroidmodelforhigh-throughputcancerdrugdiscovery[J].ExpertOpiniononDrugDiscovery，2012，7（9）：819-830.
[5]KarlssonH.LossofcancerdrugactivityincoloncancerHCT-116cellsduringspheroidformationinanew3-Dspheroidcellculturesystem[J].ExperimentalCellResearch，2012，318（13）：1577-1585.
[6]JangK.Developmentofanosteoblast-based3Dcontinuous-perfusionmicrofluidicsystemfordrugscreening[J].AnalyticalandBioanalyticalChemistry，2008，390（3）：825-832.
[7]HartmanO.Microfabricatedelectrospuncollagenmembranesfor3-Dcancermodelsanddrugscreeningapplications[J].Biomacromolecules，2009，10（8）：2019-2032.
[8]GoodmanTT，NgCP，PunSH.3-DTissueculturesystemsfortheevaluationandoptimizationofnanoparticle-baseddrugcarriers[J].BioconjugateChemistry，2008，19（10）：1951-1959.
[9]PrestwichGD.3-Dcultureinsyntheticextracellularmatrices：newtissuemodelsfordrugtoxicologyandcancerdrugdiscovery[J].AdvancesinEnzymeRegulation，2007，47（2）：196-207.
[10]BiskupB.DielGrowthcycleofisolatedleafdiscsanalyzedwithanovel，high-throughputthree-dimensionalimagingmethodisidenticaltothatofintactleaves[J].PlantPhysiology，2009，149（3）：1452-1461.
[11]SeanoG.Modelinghumantumorangiogenesisinathree-dimensionalculturesystem[J].Blood，2013，121（21）：E129-E137.
[12]LucaAC.Impactofthe3Dmicroenvironmentonphenotype，geneexpression，andegfrinhibitionofcolorectalcancercelllines[J].PlosOne，2013，8（3）：201-203.
[13]WangW.3Dspheroidculturesystemonmicropatternedsubstratesforimproveddifferentiationefficiencyofmultipotentmesenchymalstemcells[J].Biomaterials，2009，30（14）：2705-2715.
[14]YoshiiY.Theuseofnanoimprintedscaffoldsas3Dculturemodelstofacilitatespontaneoustumorcellmigrationandwell-regulatedspheroidformation[J].Biomaterials，2011，32（26）：6052-6058.
[15]BreslinS，O'DriscollL.Three-dimensionalcellculture：themissinglinkindrugdiscovery[J].DrugDiscoveryToday，2013，18（5-6）：240-249.
[16]AchilliTM，MeyerJ，MorganJR.Advancesintheformation，useandunderstandingofmulti-cellularspheroids[J].ExpertOpiniononBiologicalTherapy，2012，12（10）：1347-1360.
[17]XuX.Recreatingthetumormicroenvironmentinabilayer，hyaluronicacidhydrogelconstructforthegrowthofprostatecancerspheroids[J].Biomaterials，2012，33（35）：9049-9060.
[18]GoodwinTJ.Reducedshearstress：amajorcomponentintheabilityofmammaliantissuestoformthree-dimensionalassembliesinsimulatedmicrogravity[J].JournalofCellularBiochemistry，1993，51（3）：301-311.
[19]SouzaGR.Three-dimensionaltissueculturebasedonmagneticcelllevitation[J].NatureNanotechnology，2010，5（4）：291-296.
[20]PampaloniF，ReynaudEG，StelzerEHK.Thethirddimensionbridgesthegapbetweencellcultureandlivetissue[J].NatureReviewsMolecularCellBiology，2007，8（10）：839-845.
[21]LeePJ，HungPJ，LeeLP.Anartificialliversinusoidwithamicrofluidicendothelial-likebarrierforprimaryhepatocyteculture[J].BiotechnologyandBioengineering，2007，97（5）：1340-1346.
[22]ZervantonakisIK.Microfluidicdevicesforstudyingheterotypiccell-cellinteractionsandtissuespecimenculturesundercontrolledmicroenvironments[J].Biomicrofluidics，2011，5（1）：25-26.
[23]KimT，DohI，ChoYH.On-chipthree-dimensionaltumorspheroidformationandpump-lessperfusioncultureusinggravity-drivencellaggregationandbalanceddropletdispensing[J].Biomicrofluidics，2012，6（3）：21-22.
[24]HuhD，HamiltonGA，IngberDE.From3Dcellculturetoorgans-on-chips[J].TrendsinCellBiology，2011，21（12）：745-754.
[25]KimH，PhungY，HoM.Changesinglobalgeneexpressionassociatedwith3Dstructureoftumors：anexvivomatrix-freemesotheliomaspheroidmodel[J].PlosOne，2012，7（6）：78-79.
[26]HuangKY.Size-dependentlocalizationandpenetrationofultrasmallgoldnanoparticlesincancercells，multicellularspheroids，andtumorsinvivo[J].AcsNano，2012，6（5）：4483-4493.
[27]ImuraY，SatoK，YoshimuraE.Micrototalbioassaysystemforingestedsubstances：assessmentofintestinalabsorption，hepaticmetabolism，andbioactivity[J].AnalyticalChemistry，2010，82（24）：9983-9988.
[28]MaL.Towardspersonalizedmedicinewithathree-dimensionalmicro-scaleperfusion-basedtwo-chambertissuemodelsystem[J].Biomaterials，2012，33（17）：4353-4361.
[29]DasT.Empiricalchemosensitivitytestinginaspheroidmodelofovariancancerusingamicrofluidics-basedmultiplexplatform[J].Biomicrofluidics，2013，7（1）：23-24.