【摘要】目的分析龙脑樟有性繁殖后代变异情况。方法以龙脑樟有性繁殖后代的3个月和12个月实生苗为材料，对其叶片的挥发油进行GC和GC-MS分析，以主要的9个成分的相对百分含量为指标对样本进行聚类，并对主要成分进行相关性分析。结果栽培3个月的幼苗产生2种化学型，即黄樟油素型和丁香酚甲醚型;栽培12个月的幼苗成分较栽培3个月的幼苗成分复杂，形成了龙脑型，同时形成了樟脑型、桉油素型、异橙花叔醇型。结论龙脑樟有性繁殖后代会发生化学变异，其中只有60%保持了母本特性。
【关键词】龙脑樟;有性繁殖后代;挥发油
Abstract：ObjectiveToanalyzethevariationsinthechemicalcomponentsofleafoilextractingfromreproductiveprogeniesofCinnamomumcamphorachvar.Borneol.MethodsTheleafoilsofthreemonthortwelvemontholdseedlingswasanalyzedbyGCandGC-MS.Accordingtoninesmaincomponentsoftheessentialoil，adendrogramofallsampleswasmadeandthecorrelationofmaincomponentswasanalyzed.ResultAnalysisonleafoilofthreemontholdseedlingsshowedtwochemotypes，safroleandmethyleugenol.Analysisonleafoiloftwelvemontholdseedlingsshowedfourchemotypes，borneol，camphor，cineoleandIsonelidol.ConclusionChemicalcomponentsofleafoilfromreproductiveprogeniesofCinnamomumcamphorachvar.Borneolisdifferent，andonly60%propagatedprogenieskeepthesamefeaturesastheirparentsofCinnamomumcamphorachvar.Borneol.
Keywords：Cinnamomumcamphorachvar.Borneol;propagatedprogenies;volatileoil
药用植物樟Cinnamomumcamphora(L.)Pvesl为樟科樟属植物，是一种开发天然精油价值很高的经济植物。同一个种内具有几个不同的化学型，是樟属植物各个种的共性和普遍现象，也是樟属植物生物多样性的独特表现形式。樟树有9个化学类型，即樟脑型、龙脑型、柠檬醛型、1.8-桉叶油型、芳樟醇型、异橙花叔醇型、黄樟素、Sepuiterpene、sesquiterpenealcohol等[1]。其中龙脑型——龙脑樟(Cinnamomumcamphorachvar.Borneol)是20世纪80年现并发展起来的新的樟树化学类型，其枝叶精油富含天然冰片(天然右旋龙脑)，是提取天然冰片的理想原料[2]。樟树传统的繁殖是采用种子育苗法，但种子繁殖最大的缺陷是后代个体变异性大，母株的诸多优良性状，如高龙脑含量性能在后代中很难稳定延续[3]。本试验研究不同生长时期龙脑樟实生苗叶片精油化学成分变化的情况，旨在为今后从植物生理学的角度研究龙脑樟以及其他化学型形成的机理提供基础，并指导今后龙脑樟的生产和应用。
1材料
龙脑樟种子来源于江西省吉安市林科所天然冰片厂龙脑樟种植基地同一棵母树，经中国中医科学院中药研究所黄璐琦研究员鉴定为樟科樟属龙脑樟植物的种子。随机从10棵龙脑樟母树的种子中各取10粒种子进行发芽，将幼苗进行栽培，分别于3个月和12个月测定叶片中的挥发油。
2方法
2.1仪器
TraceGC气相色谱仪，FID检测器，hp-5毛细管柱，NIST谱图库检索。
2.2色谱条件
载气为氮气，柱温为50℃，进样口温度230℃，检测器温度240℃;升温程序：50℃以3℃/min升温速率升至220℃，保持10min。
2.3质谱条件
TRACEMS;离子源：(EI+)质量范围：35～300amu;扫描周期：5s/dec。
2.4样品提取方法
分别取幼苗叶片约1g，剪碎混合均匀后浸泡1h，用水蒸气蒸馏法提取叶片中的挥发油。所得挥发油进行气相色谱法(GC)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析，采用峰面积归一化法确定其主要组份的相对百分含量，GC-MS确定化合物的化学成分。
3结果与分析
3.1栽培3个月幼苗叶油的分析结果
GC和GC-MS分析表明，幼苗叶片精油中含量较高的成分主要有黄樟油素和丁香酚甲醚，但精油中龙脑的含量很低，甚至没有。栽培3个月的幼苗叶片精油发生了种内化学变异，主要存在2种化学型，一种以黄樟油素为主成分，另一种以丁香酚甲醚为主成分。见图1、图2。
注：A.黄樟油素;B.丁香酚甲醚
图1黄樟油素化学型GC图谱图2丁香酚甲醚化学型GC图谱
3.2栽培12个月幼苗叶油的分析结果
GC和GC-MS分析表明，植株叶片精油含量较栽培3个月的植株高，且成分较复杂，含量相对较高的化学成分是龙脑、樟脑、1，8-按叶油素、黄樟油素、萜品醇、水芹烯、α-蒎烯、异橙花叔醇、乙酰龙脑等，共占叶油化学成分总含量的80%左右。叶片精油也发生了种内化学变异。
3.2.1叶油化学成分聚类分析为分析有性繁殖后代植株的变异情况，笔者以9个主要成分的面积归一法百分含量为指标，对龙脑樟有性繁殖后代实生苗进行聚类。具体分析方式如下：用SPSS软件中的Hierarchicalclusteranalysis(分层聚类)，分类方法采用Between-groupslinkage(组间连接)，距离公式为SquaredEuclideandistance，对上述样品进行聚类分析，结果见图3。
图3龙脑樟有性繁殖后代叶油化学成分聚类
由图3可以看出，对比每个观测量的化学成分含量与聚类的结果，发现35份观测量聚为4类时，类间距离比较大，因此，根据龙脑樟树有性繁殖后代叶片精油主要化学成分的聚类结果将龙脑樟树有性繁殖后代分为4类化学型，这与我们根据GC图(见图4)主峰成分进行分类的结果一致。
3.2.2叶油各化学型分布分析为分析变异规律，对变异的各个类型进行分析统计(见表1)。由表1可以看出，龙脑樟有性繁殖后代，只有60%能保持母本特性，主成分为龙脑，其他40%后代变异为桉油素型、樟脑型和异橙花叔醇型，而没有后代变异为芳樟醇型。
3.2.3主要成分相关性分析使用SPSS统计软件对龙脑樟有性繁殖后代精油中的主要9个成分的相关性进行分析，发现桉油素分别与水芹烯和萜品醇呈极显著正相关(相关系数分别为0.990和0.978);龙脑分别与萜品醇、水芹烯、桉油素、樟脑、异橙花叔醇和异丁酸橙花酯呈显著负相关，相关系数为-0.531、-0.527、-0.397、-0.530、-0.358和-0.352，异橙花叔醇与异丁酸异橙花叔醇呈显著正相关，分析结果见表2。表2主要化学成分之间相关性分析结果(r)
4讨论
4.1叶油主要成分生源关系的分析
由表2看出，桉油素与萜品醇有极其显著的相关性，相关系数达到0.9以上，我们从单萜的代谢途径中发现萜品醇是桉叶油合成的前体物质。龙脑与其他三类的樟脑、桉油素、异橙花叔醇有显著的负相关，龙脑、樟脑、桉油素为单萜化合物，它们三者存在共同代谢途径，在生物合成途径过程中竞争同一反应底物，即一种底物形成多种化合物，一种次生代谢产物形成多，另一种或几种则形成少或没有;而龙脑与异橙花叔醇也都为萜类化合物，也具有共同的前体物质，存在竞争关系，次生代谢物龙脑产生的多则异橙花叔醇则产生的少或没有。异橙花叔醇与异丁酸橙花叔醇有极其显著的相关性，相关系数达到0.9以上，揭示异丁酸橙花叔酯可能是异橙花叔醇合成的前体物质。根据文献报道[4-5]的萜类生源学途径、单萜代谢途径及其各个成分之间的相关性推导出4种化学型的生源学途径(见图5)。
注：
图5各化学型主成分生源学关系
4.2龙脑樟化学型形成与植物的生长发育阶段有关
栽培3个月的幼苗虽然也产生了种内化学变异，但是主成分是黄樟素或丁香酚甲醚，龙脑的含量很少甚至没有，这与报道的樟植物幼根中的主成分相似[1]。然而，栽培了12个月后植株叶片精油才分化出龙脑型。因此，这可能表明龙脑樟化学型形成与植物的生长发育阶段有关。植物在不同的生长发育阶段具有其特殊的新陈代谢机制，而这种特殊的新陈代谢机制影响了植物的次生代谢产物的生成，因而影响了植物体内各种次生代谢产物的有无或者之间的比例，因此还应该从植物生理角度研究不同化学型形成的机理。程氏等[6]在研究细毛樟时也发现其有性繁殖后代1年以下植株叶片精油主成分不发生分化，而1年以上才发生分化。杨氏等[7]在研究细毛樟香叶醇合酶基因时也发现香叶醇的合成与储存器官是植物叶片的油细胞。
4.3龙脑樟有性繁殖后代变异的原因
从同一株龙脑樟母树上采集的种子在外部形态上没有明显的特征性差异，且繁殖栽培1年获得的实生苗从外部形态上看植株没有显著的区别，但叶片的挥发油主成分发生了变化，子代只有60%的实生苗能够保留原有的化学型，其余子代则发生了变异，20%的植株变异成油樟，11.43%的植株变异成脑樟，8.57%的植株变异为异樟，但是没有变异为芳樟醇型的植株。文献报道，同属植物细毛樟(C.tenuipilum)叶油中富含芳樟醇、香叶醇、金合欢醇等化学型的有性后代中只有56%～68%的植株可保持母本的特性，其他的植株分化为别的化学型[8]，细毛芳樟(CinnamomumtenuipilumKosterm)有性后代经香韵初步鉴别的208株中，含芳樟醇的有142株，占总株数的68.27%，不含芳樟醇的有66株，31.73%[9]。这表明樟属植物普遍存在有性后代叶油主成分发生变异的现象。
植物的产量、品质、化学成分等大多是数量形状，是由多基因所控制，所以变异的产生可能源于多基因位点控制的效应，这种多基因位点控制的酶不同，促使不同化学成分的积累。龙脑樟有性繁殖后生化学变异可能源于个体发育的差异，而个体发育差异受多方面因素的影响，如母性遗传效应、营养条件不同或发育阶段、年龄不同等[10]，我们在试验中控制了营养条件和发育阶段使其一致，而自然授粉种子繁殖的樟树因周围生长的不同化学型而使基因重组，产生了不同的化学变异，因此变异情况可能与周围生长的化学型密切相关。文献报道某种化学型比较多则是在子代就比较容易变异成该种化学型[4]，我们在调查过程中也发现本实验采用的龙脑樟母本植物周围存在油樟、异樟、脑樟，但没有发现芳樟醇型的存在，在吉安种植区内芳樟醇型的植株也比较少，且只开花不结果。
另外，在相同的外部环境生长的龙脑樟有性繁殖后生了变异，这也可能是因为植物内环境如内生菌起一定的作用，有文献报道发现植物的内生菌在特定的环境和生理条件下，能将植物体内和外源的化学物质转化产生另一类化合物[11-12]。本试验室也对樟树5个化学型的内生菌进行研究，发现在不同化学型中存在特异内生真菌，但其是否影响不同化学型化学成分的生成积累，还有待于进一步研究。龙脑樟后代繁殖之所以发生变异，其原因可能是由多基因控制的遗传效应和环境效应的作用。
参考文献
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[关键词]香樟栽培
香樟[Cinnamomumcamphora(L.)PresⅠ]是樟科樟属常绿乔木,其木材纹理细致,具香气,能驱虫,耐腐力强,为名贵木材之一;植株各部分是提取樟脑、樟油的原料,广泛应用在工艺、化工、医药和国防工作。同时其对土壤要求不严,较耐水湿,主根发达,深根性,能抗风,四季常绿,主干通直挺拔,分枝和萌芽能力强,树冠宽大而冠形优美,是福建省乡土树种之一;在厦门市栽培由来已久,特别在翔安区大帽山农场仍保存一群上百年的古香樟树。
笔者从2002年~2008年在厦门市集美区对香樟种植进行观测,结合香樟的生物学及其生长习性,总结香樟栽培技术。
1采种及种子处理
选择健壮母树,主干明显通直、分枝高、树冠发达、无病虫害、结实多的30~50a生母树林,于10月上中旬成熟时采集。果实属浆果状核果,容易发热发霉变质,要随采随处理。处理方法是:将鲜果浸水2~3d,除净果皮,再拌草木灰脱脂12~24h,洗净阴干后,即可运输贮藏。
2种子育苗
2.1圃地选择
圃地应选择水源充足便于灌溉的地方;土壤深厚,肥沃湿润,酸性或微酸性的砂壤土,排水良好的山坞田(地)。施足基肥,同时对土壤进行消毒处理,一般用3%克百威22.5~37.5kg/hm2。
2.2播种
播种前,用0.5%的高锰酸钾溶液浸种1~2h,进行消毒杀菌。然后进行一段时间催芽,待种壳开始龟裂,种胚微微突起即可播种,播种量150~225kg/hm2。播种以条播为宜,条距20~30cm,株距4~6cm。播后覆土,厚度以不见种子为度。
2.3苗期管理
种子萌发出苗后,必须及时进行中耕、除草、灌溉、施肥、培土、病虫害防治等一系列的壮苗措施。刚出土时,揭去覆盖的稻草,让幼苗得到充足的光照。幼苗出齐、子叶完全展开并要长出真叶时应间苗,去弱留壮,去密留稀。不论阴天或晴天,及时浇透一次定根水,遇到干燥、暴晒的天气要采用“干透浇透”的浇水方法,连续3~4次即可,不能勤浇水。施肥应掌握苗木生长最快的时期进行,6~8月追肥效果最好,追肥一般2~3次,前二次可用尿素52.5~75kg/hm2,最后一次可用尿素150kg、磷肥112.5kg,并加强管理,中耕除草。7~8月要注意病虫害防治,用40%乐果200~300倍液喷杀防治樟梢卷叶蛾,90%晶体敌百虫4000~5000倍液喷杀防治樟巢螟,波美0.3~0.5度的石硫合剂防治白粉病,800~1000倍多菌灵或甲基托布津防治立枯病和猝倒病。如条件允许,做好切根和嫩苗移植。当苗木长出真叶3~5片时,用锋利铁铲与苗株成45度的角度切入,深度以5~6cm为适当。嫩苗移植在4月份进行,挖起撒播的嫩苗,切断主根,用竹扦于行距25cm、株距6cm的移植沟内插移植,苗根稍压实。
3造林
造林主要用1a生苗植树造林。在起苗时如土壤干燥,要提前一天浇水润根,用锄头、锹等农具松土起苗,不宜用手强拔。采用ABT生根粉浸根处理,促进苗根生长,提高造林成活率。造林时间从11月到次年3月都可以,以2月上旬到3月中旬造林的成活率为最好。栽植密度按株行距2m×2m。为提高造林成活率,适当剪除部分或全部叶片以及离地面30cm以下的侧枝,并适当修剪过长的主根。造林地应选择日照较短、肥沃湿润的山场,根据林地坡度和地被物等情况进行全面或局部整地。幼林阶段主要是中耕除草,深翻扩穴,抹芽修枝等工作,不断改善林木生活环境条件,提高林木生产力。造林的前三年每年抚育2~3次,同时防止人畜践踏,第一年最好施一次农家肥。3~4a幼林开始郁闭,林地杂草减少,每隔1~2a砍杂灌、松土1次。造林的第一年要预防日灼的危害,如能在林内间种农作物,以耕代抚是促进林木生长较有效的办法。香樟多萌生枝,影响主干生长。在造林头四年要进行抹芽,之后根据生长情况适当修枝,加快主干高生长。修剪要注意保持树冠,修剪宜在冬末春初进行。对树体1/3以下侧枝全部剪除,2/3以下树体选留,其侧枝方位分布应均匀,留3~7个层次。过多修枝、抹芽会影响林木生长,使树体失去平衡,因此应注意修剪的量和次数。
地被植物在栽培及应用过程中会遇到一些问题，其中所种植物的生长特性、光合特性及耐荫性是十分重要的指标。该文选择丁香林下9种新引进的地被植物，对其生长特性、光合速率、耐荫性进行比较和讨论，希望能为城市地被植物的合理配置、发挥生态效益提供理论依据。
截至目前，国内外学者建立了许多光合作用对光的响应模型[1]。这些模型被广泛应用于植物生理、生态等方面的研究，如用这些模型拟合植物的光响应数据可以给出植物叶片的主要光合参数：光补偿点（Lc，p）、光饱和点（Ls，p）等，这对鉴定某植物的耐荫性十分重要[2]。植物耐荫性与光补偿点、表观量子效率、净光合速率、叶绿素a与叶绿素b含量、叶绿素a/b值有关，根据变量分类的结果分别赋予一定的权重，计算出园林植物的耐荫性得分。
1材料与方法
该试验所有测量工作均于7月中下旬在北京市崇文区天坛公园祈年殿西侧的丁香林下进行。此丁香林占地6300m2，种有丁香240丛，树龄近50年，为分区种植，片区域面积80~100m2，每片区内种植丁香3~5株，郁闭度约为0.5，属中度郁闭。9种新引进的地被植物分别为宝铎草、大叶铁线莲、粉花玉簪、铃兰、轮叶百合、落新妇、兔儿伞、蚊子草、玉竹，均种植于丁香林下（属半遮荫条件，）分区内。对上述9种植物进行植物株高（cm）、植株叶片数（片）、植株叶表面积（cm2）、植株叶绿素含量（SPAD）、光合速率[μmolCO2·/（m2·s）]、光照强度（lx）的测定。
2结果与分析
2.19种地被植物高生长量比较
通过调查得出，植株最高的为大叶铁线莲（98.25cm），误差值为6.42；其次是轮叶百合（78.25cm），误差值2.59；其余7种地被植物玉竹、宝铎草、蚊子草、兔儿伞、落新妇、粉花玉簪、铃兰的植株高度均在正常值范围内[3]。
2.29种地被植物叶面积指数的分析
通过调查得出，玉竹、大叶铁线莲、落新妇、轮叶百合、宝铎草、铃兰、粉花玉簪、蚊子草、兔儿伞的叶面积指数均在正常范围内[4]。其中，大叶铁线莲叶面积指数最大，表明植株叶片的重叠性高、遮光性强，种植时可适当调整种植密度，以达到理想的效果。
2.3叶绿素含量比较
结果表明，叶绿素含量最高的是铃兰，为48.2SPAD，误差值为4.01；其次依次为兔儿伞、大叶铁线莲、落新妇、粉花玉簪、轮叶百合、玉竹、蚊子草、宝铎草，植物的叶绿素含量受光照强度及自身遗传特性的影响，不作为耐荫性分析的主要因素进行考虑，仅用作参考值。
2.4光—光响应曲线分析
根据光—光响应曲线等数据，并结合目前国际上唯一商业化的光合数据分析软件Photosynassistant进行分析，结果表明，丁香林下9种地被植物的光补偿点由大到小依次为蚊子草>大叶铁线莲>粉花玉簪>玉竹>铃兰>轮叶百合>兔儿伞>宝铎草>落新妇。
3结论与讨论
试验结果表明，处于丁香林下的半遮荫环境中，四周CO2浓度为（300±20）μmol/mol、叶片温度设为（25±1）℃条件下，9种地被植物均具有低光补偿点（大叶铁线莲>粉花玉簪>玉竹>铃兰>轮叶百合>兔儿伞>宝铎草>落新妇。植物光补偿点的高低是评价植物耐荫能力的最直接标准[5-6]，即9种地被植物的耐荫性由强至弱依次为落新妇>宝铎草>兔儿伞>轮叶百合>铃兰>玉竹>粉花玉簪>大叶铁线莲>蚊子草。
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