摘要：该文介绍了微透析取样技术的原理，组成以及微透析探针的类型，对常用测定微透析探针回收率方法的优点缺点进行了比较，综述了近年来国内外有关微透析技术的应用进展，显示该项技术在研究领域具有广阔的应用前景。
关键词：微透析；回收率；应用
微透析(microdialysis)技术是将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种新型生物采样技术，可在麻醉或清醒的生物体上使用，特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究。目前已成为实验神经生理学和神经化学的重要研究工具之一，它可提供递质释放、摄取和代谢的必要信息。随着微透析采样和检测灵敏度的不断提高，微透析技术迅速发展起来，成为生物化学研究中一个引人注目的新领域。从20世纪90年代起这项技术在生命科学研究中进入高潮。微透析取样装置主要由微量泵、微透析探头、收集器、连接管及配套设备［1］组成。微量泵以注射泵为佳，有利于减少恒流泵和蠕动泵的波动，流速一般为1~5μl/min。微透析探头有直线性探头、环形探头、同心型探头等不同的类型(微透析管因实验对象不同而形状大小各异)；按照探头的形状分为穿颅探头、U型探头、I型探头、环形探头等（图1）。目前普遍应用的是同心型探头，微透析探头通常是由一管式半透膜与不锈钢、石英或塑料毛细管构成双层管道；长度一般为1～10cm。半透膜由再生纤维素、聚碳酸酯或聚丙烯腈制成（图2），载留分子量5～10KD不等。实际应用需根据具体组织和待测物选择不同的微透析探头。
图1探头类型（略）
图2微透析探针（略）
微透析主要原理是以透析原理作为基础，通过对插入生物体内中的微透析探头在非平衡条件下进行灌流，物质沿浓度梯度逆向扩散，使被分析物质穿过膜扩散进入透析管内，并被透析管内连续流动的灌流液不断带出，从而达到活体组织取样的目的。微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体(invivo)、实时(realtime)和在线(online)取样，特别适用于研究生命过程的动态变化。微透析技术的优点是活体取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等。该技术的另一大优点是样品的采集与分析过程既可在位又可离位进行。此外微透析技术的独到之处是可以单独取得细胞外液，因此可对体内神经递质的释放量进行动态监测，具有重要的生物学意义。在国外已成功地用于测定细胞外液中的多种神经递质［2］、氨基酸［3］、葡萄糖［4］、腺苷及其代谢产物［5］等小分子化合物。然而微透析技术一直困扰人们的问题就是如何对取出的样品进行准确可靠的校正，这就涉及到对探针的回收率的测定。探针回收率是指从灌流液中流出的待测组分与标准浓度之比的百分数。探针回收率是影响微透析结果的重要因素，取决于取样部位的生物学性质、透析膜的物理性质(材料、孔径、长度及几何形状等)、待测物质的分子量、灌流速度、压力、生物体本身的健康条件和生物节律等。目前测定回收率的方法主要有以下几种：
1外标法
只需要计算被测物质相对浓度的变化时，可简单地采用体外回收率法。测定宜在取样后立即进行，将探针放入已知浓度的标准溶液中，用与体内实验相同的流速灌流探针。达到稳定状态后收集灌流液并进行检测。测定浓度与标准溶液浓度之比就是体外回收率。此法虽简单易行，但由于被测物质在体外时与体内的环境状况不同，检测结果不能严格地等同于实际的回收率。
2内标法
［6］是往灌流液中加入已知浓度且性质与被分析物质相似的另一种物质做内标，内标物不仅在扩散性质上与被分析物一致，而且还要在体内的代谢过程中也尽可能一致，测出透析率即作为被分析物的回收率。由于选择内标的局限性很大，限制了此法的应用。
3反透析法
［7］假设被测物从两个方向通过半透膜是同等的。在灌流液中加入一定浓度的内标物(Cic)，在与体内透析相同的条件下操作，测定透析液中内标物的浓度(Cec)，体内回收率(Rin，vivo)可用下式计算：Rinvivo=(1Cec/Cic)×100%本法要求内标物具有生物惰性，尽可能与被测物相似。
4低流速法
［8］低流速法是将灌流速度尽量降低，一般控制在50nl/min以下，使回收率尽量达到100%，此时便无需进行回收率校正了。此法取样体积很少(一般在5μl以下)，不但对仪器的检测灵敏度要求极高，而且取样时间长易造成样品的挥发或氧化。此外还有外推至零流速法(extrapolationtozeroflow)［9］和零净通量法(zero-netflux)［10］。微透析只是一项取样技术，要进行体内物质测定必须要与分析仪器联用，以便于有利于对微量样品进行实时和在线分析测定，减少操作误差。微透析时选取适当微透析膜的截留分子量，免除了复杂的样品前处理及由此而产生的样品损失和误差，也不会因在室温取样而酶解，提高了样品的稳定性，使微透析液中可不含蛋白质和酶等生物大分子，同时由于微透析取出的样品体积小，约为μl级，易于挥发，因此取出后不易久放，能直接进入分析仪器进行测定。常用的有高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)、质谱（MS）及激光诱导的荧光检测器等，可从容地进行分离和测定。利用微透析技术进行动物实验主要是在被限制动物或麻醉动物身上，也可用于自由活动的清醒动物，应用最多的脑功能的研究，近年来该技术的应用已取得很多的科研成果。脑：在颅内手术，Hutchinson等［11］利用微透析方法与其他监测手段研究动脉瘤手术的情况，得出:患者稳定期脑氧压2.0~6.0kPa(15~45mmHg)之间；葡萄糖含量在0.5~3mmol/L之间，乳酸/丙酮酸比值＞30，在32~65之间则暗示有厌氧代谢，3min＜的短暂夹闭不会引起脑氧量减少或乳酸/葡萄糖比值的升高；长时间夹闭则会有副作用。万登峰［12］等应用微透析技术动态收集大鼠轻、重度脑损伤局部的细胞外液(ECF)透析液，观察其葡萄糖含量(［Glu］d)和乳酸含量(［Lac］d)变化。透析管插入引起［Glu］d和［Lac］d的变化很小(P＜0.05)；脑损伤后［Glu］d下降，与对照组及损伤前相比相差显著(P＜0.05)，且损伤越重其变化越显著(P＜0.05)；而脑损伤后［Lac］d则上升，与对照组及损伤前相比相差显著(P＜0.05)，且损伤越重其变化亦越显著(P＜0.05)；脑损伤后［Glu］d和［Lac］d的变化分别与脑组织含水量呈显著负相关(P＜0.05)和显著正相关(P＜0.05)。皮肤：Sjogren等［13］选用聚乙烯砜膜(100kD)探针测定皮肤在探针插入这一微创条件下白介素-6的产生，为测定复杂的细胞因子系统提供了技术参考。金属离子与一些皮肤病的发病有关，但活体皮肤离子浓度测定一直较难实施，Leveque等［14］以该技术联用原子吸收光度计测定真皮铁离子浓度，证实微透析可用于皮肤离子测定。此外还可进行血液、脂肪、肌肉中药物浓度的变化。由于物质跨膜扩散是双向性的，微透析技术除了可用于监测体内环境的生化改变外，还可作为一种给药途径。可将药物缓慢、直接地作用于靶器官，提高药效分析和药物代谢动力学研究的水平，特别是局部直接给药更能显示出这种方法的优越性。阳晓等［15］研究发现，在实验性大鼠的腹透液中加入川芎嗪长期进行腹膜透析(PD)，腹膜间皮细胞结构基本完好，间皮下无明显的基质沉积，且大鼠PD的超滤量显著提高，小分子物质的清除率增加，而对透出液中蛋白质浓度则无明显影响。微透析技术已用于测定直接人脑实质的药物浓度［16］，并可帮助诸如爱滋病毒（HIV）感染病人选择合适的穿透血脑屏障的药物。但微透析技术仍存在一些不足，微透析技术的不足之处在于探针的植入会造成局部轻微的损伤。特别是对急性实验可能有一定程度的影响。回收率的测定虽然种类繁多，但每种方法都不够完善，影响了实际浓度的计算。由于采用的方法不同在检测浓度极低的生理活性物质时不同作者的报告有时可能相差近一个数量级。微透析技术要求探头必须准确插在同一取样部位，因此不适合对很小的脑内神经核团采样。由于透析膜体积小，灌流液的流速低(一般1～5μl/min)，很难进行以秒为单位的动态观察。
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关键词：临床常用微生物学检查标本常见细菌常见真菌临床意义
【中图分类号】R9【文献标识码】B【文章编号】1671-8801（2013）02-0249-02
近年来，微生物检验技术已成为临床医学中用于进行疾病确诊的有效方法之一，而微生物检验中培养基的质量是检验结果可靠性和有效性的保障[1]。本文将对我院自2011年1月1日至2012年12月31日临床微生物检查情况进行分析，从而探讨临床常用微生物学检查标本常见细菌、真菌种类及微生物学检查对临床疾病治疗的意义，现结果如下。
1资料与方法
1.1一般资料。本文将对我院自2011年1月1日至2012年12月31日对临床微生物检查情况进行分析，共有5781份微生物检验样本，按照年份不同对所有临床微生物学检查标本进行分组，即2011组2709份以及2012组3072份。2011组2709份微生物学检查样本中内科为2135份，外科为622份。患者年龄在7天至84岁之间，平均年龄为49.23±1.44岁，其中粪便样本为512份、痰液样本为1034份、尿液样本为1163份；2012组3072份微生物学检查样本中内科为2344份，外科为680份，患者年龄在7天至82岁之间，平均年龄为49.72±1.36岁，其中粪便样本为564份、痰液样本为1387份、尿液样本为1121份。2011组与2012组临床微生物检查标本在科别、来源、患者年龄等一般资料无统计学意义，且P>0.05，两组微生物检查标本具有临床可比性。
1.2方法。对2011组2709份微生物检查标本与2012组3072份微生物检查标本进行临床分析，对痰液标本、粪便标本以及尿液标本均采用相对应的检查方法，观察并记录细菌、真菌检出率以及我院所接受的5781份临床微生物检查标本进行临床回顾性分析，记录其检查结果，如检出率、病原菌分类以及临床常见细菌、真菌具体情况等，给予统计学分析，得出结论。
1.3统计学方法。所有数据均使用SPSS13.0软件包进行统计学分析，对于计量资料用X±S表示，采用t检验，计数资料采用X2检验，以P
2结果
2011组与2012组微生物检查标本检出率、病原菌分类情况见表1。
由表1可知，2012组总检出率为85.74%，明显大于2011组总检出率77.45%，但革兰氏阳性菌阴性菌检出率无明显变化，而革兰氏阳性菌检出率明显减小，真菌检出率明显增多，且P
3讨论
本文研究结果可知，病原菌种类的变化情况为革兰氏阳性菌致病率有所下降，而真菌发病率有所上升，革兰氏阴性菌致病率无明显变化。其原因为近年来临床对于疾病治疗中，出现抗生素。免疫抑制剂以及糖皮质激素等药物的不合理应用，以及较多的采用侵入性操作治疗、放疗、化疗等治疗方法。临床主要检出的革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌以及链球菌属等；临床主要检出的革兰氏阴性菌包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形菌属以及肺炎克雷伯菌等；临床主要检出的真菌包括光滑假丝酵母菌、白色假丝酵母菌、葡萄牙假丝酵母菌以及热带假丝酵母菌等。
本文结果中显示，2012年临床微生物检出率较2011年有显著提高，其原因为2012年我院对临床医学检验进行系统化具体化的质量管理措施。医学检验质量管理分为分析前、分析中以及分析后三个阶段。医学检验分析前的质量管理工作内容主要包括申请检验、患者采集样本准备工作、样本的采集、样本运输等，是对样本到达实验室进行分析前的所有内容[2]。研究表明，由医学检验分析前造成的误差是整个医学检验误差率的70%以上[3]，若在对患者进行医学检验分析前不采取规范化的质量管理，则会对检验结果造成很大影响，使临床医生对患者病情出现误诊、漏诊现象，从而贻误患者最佳治疗时间，造成严重后果[4]。因此，临床进行医学检验时应重视分析前的质量管理，从而提高医学检验的准确率，降低误差率，才能对患者病情进行快速准确的判断，使患者及时接受治疗并达到较为满意的预后效果。
临床微生物检验质量控制：对患者信息进行采集时，应遵循耐心细致的原则，若发生异常情况应及时与患者进行沟通，并给予患者反馈信息，从而快速解决异常情况，避免不必要的情况发生。护理人员应在患者进行样本采集前及时细致的告知患者相关要求，如空腹、不使用禁忌药等，从而保证样本采集工作的顺利进行。对患者详细讲解样本采集相关知识，以及将要进行的样本采集措施主要内容，消除患者的紧张、恐惧等负面心理情绪，使患者保持轻松心态接受样本采集。叮嘱患者在进行样本采集前应保证充足的休息，才能使样本检验结果更为准确可信。对样本采集仪器以及采集试剂进行妥善保管，仪器应进行定期养护，试剂应详细记录生产厂家、批号、使用日期等基本信息，若发现异常问题，如试剂过期或仪器故障等，检验人员应及时进行处理，从而提高检验结果准确率。定期对检验人员进行专业素质培训，如对仪器的使用、试剂的使用、检验结果的分析等，从而保证检验结果准确性，降低人为误差的发生率。对患者进行样本采集时，应尽量留存较多样本，从而避免由于样本采集量过小，检测不出病变成分的现象。患者进行样本采集之后，护理人员应及时将样本送检，检验人员也应及时进行临床检验，在样本保存过程中应严格执行无菌操作，避免发生污染，从而使检验结果更为准确可信。若所送检的样本不符合相关要求，检验人员有权拒绝检验。
综上所述，临床需对细菌、真菌等病原菌的致病率进行控制，首先应严格按照相关规定给药，尽量减少临床不合理用药情况，同时应严格控制临床微生物检验质量，确保检验结果的准确性，为临床确定患者治疗方案提供可靠依据。参考文献
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关键词：微生物检测技术；食品检验；应用方法
微生物检测技术是依据微生物学理论，结合现代免疫学和自动化仪器等理论知识与技术，通过科学检测方法进行病原微生物种类、数量和性质等方面的研究，具有检测速度快、检验的灵敏度高和检验结果准确等优点。因此，分析微生物检测技术在食品检验中的应用方法，对保障食品安全性，为社会民众创造良好食品环境有着重要的意义。
1食品检验的重要性及操作基础
1.1食品检验的重要性食品检验不仅关系到社会民众的身体健康，而且在市场监管、产品贸易和食品质量的安全评价中起着重要的支撑作用，对食品行业的持续健康发展有着积极的推动作用。同时，食品检验与社会民众的身体素质息息相关如果食品检验没有做到规范与合格，会降低社会民众的工作效率，进而对社会的发展产生不利影响。
1.2食品检验中的操作基础食品检验的操作基础主要包括样品采集与保管、试样制备与预处理和食品检测技术的选择等。在样品采集的过程中，采集人员需要保证采集样品的代表性，并妥善保管采集的样品，避免因外界因素对样品造成干扰。在进行样品检测前，检测人员可以采用蒸馏、层析、透析、沉析和浓缩干燥等方法，去除样品中无分析价值的杂质，以保证检测结果的准确性与可靠性。在选择检测技术和检测方法时，检测人员需要考虑样品的特性、检测的要求和实验室条件等多方面的因素，保证检测技术与检测方法的适用性。
2微生物检测技术的特点与基本的检测技术
2.1微生物检测技术的特点在食品检验中，微生物检测技术主要有如下特点：①检验的范围比较广，包括有食品工业的微生物，如保健食品中的双歧杆菌和乳酸菌等；人类疾病、畜禽疫病和共有传染病中的病原微生物，可以通过食物途径进行传播，数量高达数百种；可以引起食品腐败和变质的微生物等；②食品维生素的检验需要保证快速准确，并且检验样品需要有一定的数量，检验的结果需要赋予法律性质，且受到的干扰因素较多。
2.2微生物基本检测技术在食品检验中，微生物检验的流程为常见的致病菌检验大肠杆菌菌群计数菌落总数的计数。其中常见致病菌主要指致病性的大肠菌、沙门氏菌、弯曲菌属和肠炎弧菌等。传统检验方法为血清试管凝聚实验、血清学分型、生化试验、毒性试验、噬菌体分型和微生物的形态检查等；常用的试验操作为明胶试验、甲基红试验、V-P试验、淀粉水试验、硝酸盐的还原试验和糖酵解试验等。传统的微生物检验方法准确性较高，检验结果相对可靠，但是其操作繁琐，耗费时间较长，涉及的试验比较多，无法满足食品检验的快速便捷要求。
3微生物的快速检测技术
微生物快速检测技术主要为如下三种方法：①电阻电导测定法。该方法是利用全自动微生物检测计数仪，通过分析食品样品的电容抗、电阻抗和总阻抗等不同参数，测定样品的污染程度，其原理是在细菌进行防治和生产时，将蛋白质和糖类等大分子物质分解为有机酸和氨基酸等小分子物质，改变并测量培养液的导电度与电阻变化，从而推算出其原样品的含菌数；②生物传感器法。生物传感是利用与生物活性物质进行物理变化和化学变化时产生的感应，以物理换能器和化学换能器对其进行捕捉，并通过离散或连续数字电信号将反应程度表达出俩，从而得到分析物浓度。生物传感器法的优势是特异性较高，灵敏度较高，可以满足复杂样品检测的要求。
4微生物检测技术在食品检验中的应用
4.1食源性病原菌免疫学检测技术在食品检验中的应用在免疫学的检测技术中，很多造价低的检验仪器设备得到很好应用，其操作简单便捷，检验的实用性比较强。在检测食品中的微生物时，免疫学检测技术应用非常广泛，如检测食源性寄生虫和葡萄球菌菌素等，在保障食品免疫中发挥着重要作用。
4.2核酸探针技术在食品检验中的应用在食品检验中，核酸探针可以快速检测食品中大肠杆菌的情况，从而对食品安全性提供正确评价。例如在检测单增李斯特菌时，可以直接利用核酸探针进行检测。核酸探针检测技术比较复杂，需要的检测费用与成本也较高，所以很多时候的检测主要是在实验室中完成，在一定程度上制约了其在食品检验中的普及度。
4.3多聚酶链反应技术在食品检验中的应用多聚酶链反应技术的特异性较强，敏感度也比较高，在食品检验中的应用比较广泛。曾有检测证明，在检测31株不同的菌株时，利用FQ-PCR检测技术，最终发现其中23株菌株为阴性，8株副溶血弧菌检测为阳性。同时，多聚酶链反应技术可以检测食品中金黄色葡萄球菌和肠出血性大肠杆菌等，检测结果的准确性也比较高。
4.4生物芯片技术在食品检验中的应用在一次性食品检验中，生物芯片技术既能检测出食品中致病菌，而且可以检测出许多隐藏致病菌，其操作简单，检测的敏感性高，可以通过一次检测得到全部检测结果。曾有检测证明，将15种细菌的16srDNA通过引物扩增，让后与芯片探针进行杂交，从而检测出食品中致病菌。虽然生物芯片技术的优点很多，但是由于芯片比较复杂，该技术仍然在试验阶段，其应用范围也不太广泛。
4.5生物传感器检测技术在食品检验中的应用导致食品腐败变质的微生物多种多样，如真菌、细菌和病毒等，其中因细菌导致食品变质情况最为常见。病原菌和腐败菌是造成食物污染的微生物组成部分，腐败菌自身并不会致病，只是通过将食品成分分解与破坏，从而使食物腐败变质，进而产生有害物质而危害人们身体健康。生物传感器检测技术可以准确检验出食品中的微生物，如乳酸菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌等腐败菌数量；沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等病原菌；真菌毒素、藻类毒素、新军毒素等生物毒素等。但是由于该技术还需要进一步完善，所以在实际的食品检验中应用有限。
5结语
在食品检验中，传统检测技术和方法不仅检测时间长，而且检测过程复杂繁琐，检测的结果也不易判断，而借助新检测技术与检测仪器设备，可以有效提高食品检验检测技术的实用性与准确性。检测人员只有把握各种检测技术的特点及适用范围，在检测时做到细致认真、规范操作，才能真正保障检测质量，对食品的安全性给出正确评价，为社会民众创造安全的食品环境。
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关键词：微卫星标记；遗传多态性；麻城黑山羊
中图分类号：S827文献标识码：A文章编号：0439-8114（2013）18-4454-04
麻城黑山羊产于大别山及其周边的广大地区，主产区在湖北麻城市，是优良的黑色地方品种资源。对于麻城黑山羊的相关研究，过去多限于体型外貌、体尺测量、生产性能测定等方面，很少在分子水平上开展研究，品种的选育尚停留在常规育种领域，严重阻碍了该品种的选育提高和进一步发展。
微卫星（Microsatellite）是广泛分布于生物基因组中的简单重复序列，20世纪80年代，Miesfeld等[1]在人类基因组的研究中首先发现了微卫星DNA，它一般由2～6个碱基组成核心单元，重复几次至几十次不等，数量庞大且分布均匀，在染色体上平均每10kb就出现一个，同时具备保守性、等显性遗传、多态性丰富、易被检测、进化所受选择压力小等特点，在物种遗传图谱构建、品种遗传多样性分析、种间遗传距离估测、亲子鉴定、数量性状基因座（QTL）的检测与定位、杂交优势预测等方面具有很大的应用价值，也使之成为继RFLP之后的第二代分子标记技术，被广泛应用于羊的遗传育种领域，为羊育种开辟了一条新的途径。
遗传多样性（Geneticdiversity）是生物多样性的基础和核心。最初采用血液蛋白多态性、酶多态性等来研究群体的遗传多样性，但结果的可信度不高。随着育种技术的发展，从分子水平上为群体遗传多态性的研究提供了更好的途径，如微卫星标记既可反映个体的遗传相似程度，又能反映群体之间的遗传相似程度，在遗传多样性评估、畜禽品种资源的分类、保护和利用等方面具有重要价值。国内外利用微卫星标记对羊品种的遗传多态性研究非常普遍。Luikart等[2]用22个微卫星标记检测山羊家系，22个标记的平均杂合度为0.6110，等位基因数2～11，其中安哥拉山羊平均杂合度为最高。Kim[3]用9个微卫星标记分析朝鲜和中国山羊，共检出62个等位基因，每个标记都具多态性，等位基因数4～10。Chenyambuga[4]用19个微卫星标记分析非洲山羊品种遗传多样性，结果每个标记均表现多态性，等位基因数均大于4。兰蓉等[5]用11个微卫星标记分析了云南肉山羊黑色品系，得到了品系内不同家系的遗传多态性信息和公羊间的亲缘关系。汤存伟等[6]研究了10个微卫星标记在新疆13个绵羊群体中的遗传多态性，计算得到的群体平均多态信息含量为0.6803，平均杂合度为0.7192。郎侠等[7]用15个微卫星标记分析兰州大尾羊，共检测到153个等位基因，群体多态信息含量0.7762。郭丹等[8]用微卫星标记研究了辽宁绒山羊的遗传多样性，7个标记均呈高度多态性，遗传多样性丰富。毛杨毅等[9]用微卫星标记研究吕梁黑山羊等4个山西地方山羊品种，5个基因座共检测到67个等位基因，多态性丰富。
本研究选择10个微卫星标记，对麻城黑山羊群体进行检测，统计分析标记的多态性、基因杂合度等，为了解麻城黑山羊的群体遗传多样性，进一步寻找与麻城黑山羊毛色、生长、繁殖等相关的遗传标记提供理论依据，为麻城黑山羊新品系的培育提供技术支撑。
1材料与方法
1.1试验材料
麻城黑山羊血样，在湖北省麻城黑山羊种羊场采集。所用的试剂包括Tris、EDTA、SDS、蛋白酶K、TaqDNA聚合酶、dNTPs等购自生工生物工程（上海）股份有限公司，微卫星引物10对（引物信息见表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2仪器设备
数显pH计、高速台式离心机、PCR扩增仪（普通、梯度）、电泳仪、凝胶成像仪等。
1.3血样采集及DNA提取
采集麻城黑山羊静脉血199头份，置于低温保温箱带回实验室。提取DNA，溶解于TE。最终提取出可用的基因组DNA样品为189头份。
1.4PCR扩增
PCR反应体系20μL：10×Buffer2μL，25mmol/LMgCl21.0～2.4μL，10mmol/LdNTPs0.4μL，8pmol/μL两侧引物各1μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，DNA模板1μL，双蒸水补充至20μL。
反应程序：95℃预变性8min；94℃变性30s，53.0～60.0℃退火30s（因标记而异），72℃延伸40s，共38个循环；72℃延伸10min，4℃保存。各反应体系引物的MgCl2用量、退火温度见表2。以2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.5统计分析
1.5.1统计软件用BandScan5.0软件获得等位基因的大小，根据公式计算各微卫星座位的等位基因频率、多态信息含量、杂合度等。
1.5.2多态信息含量采用以下公式计算多态信息含量（PIC）。
2结果与分析
2.1PCR扩增产物的电泳结果
由图1可知，BM1329等10个微卫星标记的PCR扩增产物的条带均为一条或两条，符合微卫星标记的基本特征，可用于后续的遗传信息分析。
2.2微卫星标记的等位基因分析
利用BandScan5.0软件进行微卫星标记的等位基因及基因频率分析，经统计得知，BM1329等10个微卫星标记共检测到171个等位基因，每个标记都检测到9个以上的等位基因，说明所选择的微卫星标记遗传信息比较丰富。在所有微卫星标记中，以BMS1591标记检测到的等位基因数目最多，为23个，其片段大小为187～273bp；其次是BM143标记，为22个等位基因，其片段大小为78～170bp；OarHH35标记的等位基因数目最少，只检测到9个等位基因，片段大小为97～125bp。
在所有检测到的等位基因中，以OarAE101标记、100bp片段的基因频率最高，为0.2391，其次是OarHH35标记、97bp片段的基因频率（0.2340）；而BMS2508标记的135bp片段、OarHH55标记的150bp片段的基因频率最低，均为0.0027。可以看到，所有基因的基因频率都不高（最高者仅0.2391），这可能是群体基因分布较均匀等因素所造成。
每个微卫星标记上观察到的等位基因数及统计后的有效等位基因数如表3所示。有效等位基因数（Ne）反映了群体遗传变异大小。有效等位基因数接近所检测到的等位基因的绝对数，表明等位基因分布均匀。根据表3中的数据，BM1329、BM3413、BMS2508和BM143等标记的等位基因观察数和有效等位基因数都相差较大（绝对相差值在6.7～8.1），说明在这些基因座上，群体的等位基因分布不均匀，遗传差异较大，这可能是由于地理隔离以及人工选择所造成。
2.3多态信息含量与杂合度
多态信息含量（PIC）用来描述微卫星标记的变异程度，用于估计群体内的遗传变异程度。一般认为，当PIC>0.5时为高度多态标记，0.25
由表4可知，本研究中的10个微卫星标记均为高度多态标记，多态信息含量都在0.95以上，说明基因变异较大，遗传多样性丰富，同时也说明本研究所选用的微卫星标记均能提供较好的遗传信息，可以反映麻城黑山羊群体的遗传多样性。其中BMS1591标记的多态信息含量最高，为0.9969，其次是BM143标记，为0.9957；OarAE101标记的多态信息含量最低，为0.9801。10个微卫星标记的平均杂合度（H）在0.7074～0.9765之间，群体遗传杂合度（h）在0.8590～0.9446之间，品种的平均群体遗传杂合度为0.9067，均属于高度杂合标记和高度杂合品种。较高的品种杂合度，表明品种的遗传多样性信息丰富；较高的微卫星标记杂合度，说明该标记所能提供的遗传信息量更大。同时，杂合度的高低，还在一定程度上反映了品种的选育过程，如所用的亲本材料来源广泛、或导入了外血、选育时间短，均会提高杂合度。
3小结与讨论
3.1小结
BM1329等10个微卫星标记共检测到171个等位基因，平均为17.1个，其中以BMS1591标记检测到的等位基因数目最多（为23个），其次是BM143标记（22个），OarHH35标记的等位基因数目最少（9个）。基因频率最高的是OarAE101标记的100bp片段（0.2391），其次是OarHH35标记的97bp片段（0.2340），而BMS2508标记的135bp片段、OarHH55标记的150bp片段的基因频率最低，均为0.0027。
10个微卫星标记多态信息含量都在0.95以上，均为高度多态标记，其中BMS1591标记的多态信息含量最高，为0.9969，其次是BM143标记，为0.9957；OarAE101标记的多态信息含量最低，为0.9801。平均杂合度在0.7074～0.9765之间，群体遗传杂合度在0.8590～0.9446之间，平均群体遗传杂合度为0.9067，属于高度杂合标记和高度杂合品种，遗传变异大。
3.2讨论
3.2.1微卫星座位的选择大量的理论研究和实践表明，研究群体的杂合度、群体间遗传距离时，所用标记的数目对结果的精确性和可靠性非常重要，数目越多则结果的精确性越高，但工作量和费用相应较高。在本研究中，选用了分布在不同染色体上（10个微卫星标记分别分布在6条染色体上）、多态性较高的标记，以尽可能提供较多的遗传信息，且扩增产物的片段大小多在80～270bp之间，便于获得扩增产物和结果统计。同时，这10个标记已有对羊的生长发育、繁殖等性状具有正效应的研究结果，便于下一步开展此方面的研究。本研究结果表明，10个微卫星标记均检测到9个及以上（平均17.1个）的等位基因，多态信息含量非常丰富，客观地反映了麻城黑山羊的遗传信息。
3.2.2电泳微卫星的PCR扩增产物多采用聚丙烯酰胺凝胶作为载体，在垂直槽上进行电泳，它的分析结果在精确度上高于琼脂糖法，但凝胶的制备非常麻烦，电泳过程耗时很长，成本也较高。近年来也有采用毛细管电泳的[5]，它是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，采用毛细管电泳原理制作的全自动分析仪，具有自动上样、高通量、检测灵敏度高、分辨率高、样本消耗少、分析快速等优点，并可进行全自动数据记录和输出胶图、条带长度和浓度。本研究采用的是较为传统的琼脂糖法，虽然其分辨效果不如前两种方法，但制胶容易、电泳时间短、效率也较高、成本较低，只要掌握好凝胶浓度、电压和电泳时间，避免出现条带未分开、边缘效应等问题，同样可取得较理想的分析结果。
3.2.3关于群体遗传多样性多态信息含量和群体遗传杂合度都不同程度地反映出品种的遗传多样性。在本研究中，麻城黑山羊的平均PIC在0.9801～0.9969之间，平均遗传杂合度在0.8590～0.9446之间，说明其遗传基础广泛、遗传多样性丰富。而平均杂合度低于平均遗传杂合度，表明品种中用于配种的种公羊数量较少，存在一定程度的近交，也可能是长期对某一性状的选择，造成整体血统狭隘，或是品种曾经历过始祖效应，这些都会造成基因纯合较多。
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光合自养型真核超微藻(PhotosyntheticPicoeukaryotes，PPEs)为粒径小于2μm的自养型真核原生生物［1］，其广泛分布于海洋和淡水生态系统中，作为重要的初级生产者，在水生生态系统的物质循环和能量流动中起着十分重要的作用．尤其在热带、亚热带贫营养海域是重要的初级生产者，对其所在海域的生物量贡献巨大［2］．1994年Li首次揭示了光合自养型真核超微藻由于具有较大的比表面积和高的碳吸收效率，是海洋初级生产力的重要贡献者［3］．国际上关于真核超微藻遗传多样性的调查和研究多集中于海洋，近几年才有少量关于湖泊的研究报道［4-5］．国内关于真核超微藻遗传多样性的研究才刚刚起步［6］，袁洁等［7］构建了我国南沙海域真核超微藻基因克隆库，发现了大量新型基因序列;王建等［8］对武汉东湖超微藻生态学进行初步研究;陈美军等［9-11］对太湖不同湖区真核微型浮游生物基因多样性进行研究，其中涉及部分微型藻类．调查真核超微藻多样性，一般将水样经过一定孔径的滤膜抽滤，然后用真核生物18SrRNA基因的通用引物扩增和克隆滤膜上的DNA，最后进行测序和序列比对、生物进化分析［12］．该方法得到的海洋和湖泊样品的克隆库中，三分之二以上的基因序列属于异养真核微生物，但荧光原位杂交方法却发现，在适宜藻类生长的水环境中，通常自养型真核超微藻相对异养真核微生物在数量上占绝对优势［13］．为了更好地揭示光合自养型超微藻的遗传多样性，Fuller等设计了针对真核藻类叶绿体16SrRNA的引物来构建基因克隆库［14］．该引物能够特异性地扩增自养真核藻类，较好地克服传统方法对异样真核微藻较高的扩增率．本研究采用真核藻类叶绿体16SrRNA的引物来构建基因克隆库，以揭示太湖自养真核超微藻的遗传多样性，从而帮助我们更全面地了解湖泊浮游藻类的群落结构及生态功能，同时为湖泊超微藻的研究和开发利用提供一定的依据．1材料与方法1．1藻样采集梅梁湾位于太湖北部，是目前太湖富营养化程度最高的区域之一，而东太湖的富营养水平在太湖几个湖区中最低［9］．2010年3月采集太湖梅梁湾(T1点)、东太湖(T2点)水样各500ml(图1)．用20μm的滤膜粗滤后分别用2μm、0．2μm的滤膜逐级抽滤，得到粒径范围为0．2～2μm的超微浮游藻类［13］．用10ml离心管收集0．2μm滤膜，加3ml细胞溶解液，－20℃保存．1．2藻样总DNA提取将加有细胞溶解液的离心管从－20℃取出，室温溶解．加入350μl10%的SDS，33．5μl10mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃水浴50min后55℃水浴20min，期间每隔10min摇匀，使反应充分．加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，10000转/min、4℃下离心5min．取上清至新离心管中，同样的方法再次抽提．将上清转移至新离心管中，加入等体积异丙醇和0．4倍体积的7．5mol/L的醋酸铵，室温静置10min后，10000转/min、4℃下离心30min．弃溶液，加入1ml的70%乙醇洗涤，10000转/min、4℃下离心15min，弃乙醇．干燥30min，使酒精充分挥发后，每管加入30μl的TE悬浮沉淀，－20℃保存．1．3PCR反应与产物的纯化以上提取的藻样总DNA用于目的片段扩增．50μlPCR反应液中含有25mmol/LMgCl2，2．5mmol/LdNTP，10×buffer，5U/μlTaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)．采用真核藻类16SrRNA基因的引物对PLA491F:5'GAGGAATAAGCATCGGCTAA3'，OXY1313R:5'CTTCACGTAGGCGAGTTGCAGC3'［14］进行扩增．扩增反应程序:95℃，5min;95℃，1min;55℃，1min;72℃，1min，循环30次，最后72℃，6min．扩增完成后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，切取PCR产物目的片段(约822bp)，用Promega公司的PCR纯化试剂盒(Wiz-ard?SVGelandPCRClean-UpSystem)进行纯化．1．4克隆子筛选PCR产物经纯化回收后与载体pGEM-TEasy连接，并转化感受态大肠杆菌，涂布于含有Amp、IPTG及X-gal的LB培养平板上，置于37℃培养箱中倒置过夜．在平板上挑取白斑单菌落转移至含有Amp的液体LB培养基中37℃，150转/min振荡培养6～8h．取1μl菌液，用pGEM-TEasy载体的通用引物T7、SP6扩增，电泳检测，对扩增出目的片段的菌液进行测序．1．5序列分析将测序获得的序列剪切掉载体和引物区，采用Bellerophon在线软件分析，随后利用核苷酸序列进行分子遗传多样性和分子系统学分析．我们将核苷酸序列相似度为98%的克隆定为属于同一OTU，代表相同的属或种［15］，否则将被认为是不同的藻．本研究共得到14个真核超微藻序列，Cluster软件分析后发现有10个OTU．采用MAFFT5．8软件(align．bmr．kyushu-u．ac．jp/mafft/online/server/)对本研究得到的10个OTU和34个参考序列进行比对，Gblocks软件剪切掉变异较大的区域，Modeltest软件计算得到针对该44个序列构建进化树的最佳参数，最后用PAUP4．0构建NeighbourJoining生物进化树，重复1000次得到Bootstrap值，用MEGA4．1软件对进化树进行编辑．2结果与分析2．1DNA的扩增与阳性克隆子筛选结果显示在822bp左右有特异性的扩增片段条带，与预期片段相符(图2)．目的片段纯化后直接与载体pGEM-TEasy连接转化获得数百个克隆，最后每个样品挑出46个阳性克隆进行测序．2．216SrRNA部分序列分析将得到的序列在NCBI上进行比较分析，发现自养型真核超微藻优势种群为隐藻(Cryptophyta)，占71．4%，其次是硅藻(Bacillariophyta)占14．3%，最后为金藻(Chrysophyta)和定鞭藻(Haptophyta)，分别占7．1%(表1)．构建NeighbourJoining生物进化树(图3)．与国内外研究结果比较，确定了部分藻的具体分类，但大部分为未培养的藻类，无法进行精确定位．分析发现本研究中得到的金藻序列EF052122、定鞭藻序列EF051968及隐藻序列如EF052243、EF052214等均与意大利Naples近海湾藻类亲缘性较近［16］，除金藻相似度为96%，其他藻类的相似度均达到98%～99%．可见湖泊与海洋的藻类组成具有一定的相似性，且隐藻等广泛分布于海洋及淡水湖泊中．硅藻序列EU580495与德国Constance湖及美国Horsetooth水库的硅藻相似度较高［17-18］，说明硅藻在全球分布广泛，且本研究发现的硅藻也多存在于湖泊中．分析发现目前国际上关于超微藻的研究也较少且相对集中，超微藻的已知种类较少．此外在本研究的克隆文库中还发现了一些序列。#p#分页标题#e#3讨论3．1方法选择本研究采用了真核藻类16SrRNA基因的引物对PLA491F、OXY1313R［14］，近年来该引物在海洋真核超微藻研究中得到了广泛应用，弥补了18SrRNA通用引物构建的基因克隆库中大部分属于异养真核微生物而非自养真核藻类的不足，较好地反映了海洋真核超微藻的遗传多样性［19-20］．由于太湖富营养化程度高，细菌含量高，实验中也扩增出部分光合细菌，但目前国际分子生物学数据库中已有大量序列可进行比较，因此可有效排除光合细菌．PCR产物克隆法构建文库是研究超微型真核生物分子多样性的传统方法［21-22］．Zuendorf等对丹麦Mari-ager海峡样品进行克隆文库的构建，对随机选取的400个克隆进行测序，最后获得70个属于不同种类超微型真核生物的OTUs［23］．这些研究均获得了丰富的超微型真核生物多样性，表明克隆文库构建方法适用于本研究，为我们客观认识环境中真核生物多样性提供途径．但构建克隆文库直接测序耗时且花费较大．DGGE是检测微生物多样性的一种快速可靠的方法，其带谱中条带的数量和亮度可相应地反映环境样品中微生物物种的数量和优势种群［24］．此方法的优点是可以同时对大量不同的环境样品比较分析，缺点是不知道样品中具体的生物组成［25］．而构建克隆文库，通过测序及网上比对，能够知道样品中主要的物种组成与相对丰度．结合两种方法，能够扬长避短，即可对不同时空的样品进行分析，也可了解样品的主要物种组成［26］．所以我们将结合这两种方法进一步研究太湖自养真核超微藻的遗传多样性．本研究目前只对太湖2010年3月份T1、T2点的样品进行初次分析，但可以推测湖泊中自养真核超微藻具有复杂的遗传多样性．我们将对太湖这些位点的水样进行进一步调查，系统地研究太湖自养真核超微藻的遗传多样性．3．2太湖不同湖区自养真核超微藻的分布T1点位于太湖污染最为严重的梅梁湾，T2点位于水质相对最好的东太湖，本文以这两个富营养化程度相差较大的湖区作为代表来反映太湖不同湖区自养真核超微藻的分布情况．结果表明T1、T2点均有隐藻和硅藻，可见春季隐藻与硅藻分布较为广泛，可能在太湖的其他湖区也存在．其中优势种群为隐藻，说明隐藻适应性强，生长旺盛．金藻多生活在透明度高，有机质含量低的水体中［27］，东太湖金藻的发现，验证了东太湖水质相对较好，能够为金藻的生长提供适宜的环境．已发现的定鞭藻主要存在于海洋中，在淡水生态系统中很少［28］．太湖梅梁湾发现定鞭藻，说明定鞭藻的生境可能比以往认识得更为广泛，还可存在于富营养化的湖泊中．本研究得到的序列经比对后发现很多未培养、系统分类未定的藻类，说明我们对于真核超微藻的研究还很有限，需要进一步加深对其的认识．
关键词：分子生物技术；环境工程；微生物领域
前言：环境工程微生物是一个综合性的学科，涉及到很多相关联的学科，比如微生物学、环境工程学、环境保护学等。同时，在微生物领域中，环境工程微生物又是一个非常重要的组成部分，在对其进行研究时，应用了分子生物技术，这样一来，在进行环境监测时，提升了监测的效果，进而在很大程度上实现了环境保护。
一、分子生物技术
（一）PCR核酸技术
在PCR核酸技术中，包含了三种不同的技术。第一，PCR―SSCP技术，在利用此种技术进行环境监测时，首先要选取监测环境的DNA样本，随后，通过PCR扩增技术，得到SSCP凝胶DNA谱带，最后，对其进行分析，采用的方法为银染法、荧光的检测技术；第二，PCR―DGGE技术，对于检测的环境，首先将样本基本组DNA提取出来，接着利用PCR扩增技术进行扩增，随后，将DNA谱带经过电泳后形成，最后，利用此项技术进行割带回收工作，将微生物的种属准确的确定；第三，PCR―RFLP技术，与前两种技术不同，此种技术在进行DNA谱带切割时，利用限制性核酸内切酶，通过与某段DNA识别序列相结合，实现最终的切割工作。
（二）PCR的测序技术
通过分子生物技术的分离，微生物环境中会出现新的群体或者生命特征，这时，就需要对新的群体或者生命特征进行类别鉴定工作，为了准确的识别，就需要相应的技术提供支持，分子生物技术中的PCR测序技术恰好可以应用在此，在进行测序工作时，此项技术依赖于转DNA，这是因为转DNA具备的稳定性是比较好的，同时，在所有的生物序列中，同源性是一个显著的特征，基于此，在对新的群体或生命特征进行研究时，具备比较好的研究效果。
（三）基因探针测试技术
所谓基因探针，是指一个单链DN段，不过，此片段具备特异性。在对微生物环境进行检测时，首要的工作就是样品的选取，样品选取完成之后，通过解链以及相应的原理，对样品进行分析。在利用基因探针进行测试时，需要进行标记工作，这样一来，即使经过杂交之后，对比工作也可以顺利的展开。近年来，基因探针测试技术所具备的应用范围越来越广，在环境工程微生物领域中将会起到非常重要的作用。
二、分子生物技术在环境工程微生物领域中的应用
（一）检测环境中的致病菌和指示微生物
在环境中，致病菌是一定存在的，近年来，随着空气污染的加剧，致病菌的数量不断地增多，通过空气、水、土壤等介质的传播，导致人类患上各种疾病，比如2003年的SARS，进而产生非常严重的影响。在环境工程中，污水处理完成之后，在进行指示微生物时，通过大肠杆菌来实现。在不同的环境中，微生物的多样性和种群是不相同的，为了对其进行分析，采用了PCR―DGGE技术与16SrRNA基因相结合的办法，分析结果表明，在传统的微生物培养中，很多微生物种群是无法进行检测的，对此，应用了PCR扩增技术，再次进行检测，这样一来，检测的效果得到显著地提升，同时，所需的检测时间也比较短。
（二）分析环境工程微生物种群的多样性和丰度
一般说来，微生物会生存在污泥、生物膜、土壤等物质中，而且生存的数量是非常多的。在对微生物种群的多样性进行分析时，同样应用了分子生物技术，首先，对地下水微生物进行收集，同时，在陶瓷表面上让其形成生物膜，通过PCR-SSCP技术，将微生物种群的多样性分析出来；其次，对微生物种群的结构进行分析，分析时，应用了测序技术，并通过16SrRNA的抽取来完成。通过分子生物技术的应用，有效的对生物膜、污泥等物质的微生物种群多样性和丰度进行了分析，在定性检测与定量检测充分结合之后，有效的支持了分析的结果。
（三）培养环境工程功能微生物
随着化学工程的发展，化学工程也逐渐的实现了现代化，在进行有机化合物的合成时，复杂程度提升，同时，排入环境的物质可降解性越来越差，这样一来，环境中的微生物就无法实现有效降解，进而对环境造成污染。为了避免环境污染的发生，提升微生物的降解能力，应用了DNA印迹技术，同时，通过分子生物技术的应用，进行了微生物的培养，培养出来的微生物具备环境工程功能，能够有效且快速的实现降解，进而有效的保护环境。
结论：分子生物技术是一项先进的技术，通过分子生物技术，能够有效地对环境中的微生物属性进行测试，基于此，在环境工程微生物领域中，大力的应用了分子生物技术，不过，由于分析生物技术应用的普及程度比较差，进而导致应用中还存在一定的问题，因此，就必须要加大对分子生物技术在环境工程微生物学领域的研究力度，从而有效地提升应用的效果，加强对环境的检测，降低环境污染。在分子生物技术不断成熟的过程中，其应用范围会变得越来越广，与此同时，环境工程微生物领域也必然会产生革命性的变化。
参考文献
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